基于双纳米复合物的比色免疫传感器及其制备方法和应用技术

基于双纳米复合物的比色免疫传感器及其制备方法和应用，涉及食源性致病菌检测领域，本发明专利技术以Fe

Colorimetric immunosensor based on double nanocomposites and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
基于双纳米复合物的比色免疫传感器及其制备方法和应用
本专利技术涉及食源性致病菌检测
，具体涉及一种基于双纳米复合物的比色免疫传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
致病性细菌感染对全球公共卫生构成严重威胁，其高发病率和高死亡率给社会带来了巨大的经济负担。细菌检测是关系公共安全的一个重要领域。为有效预防病原菌感染，开展护理点(POC)病原学检测对临床诊断、食品检验和环境监测具有重要意义，特别是在世界欠发达地区，意义更加巨大。传统用于细菌检测的方法有平板计数法、聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附(ELSA)等，它们作为灵敏、高效的微生物定量方法被广泛地使用。但是这些方法存在较长的细菌培养时间、特殊的样品前处理、抗干扰能力差等缺点。因此，开发一种快速、灵敏度高、特异性强的细菌检测方法，具有重要意义。目前用于抓取细菌的单元包括抗体、适配体、抗生素等。适配体的稳定性较高，特异性也高，但是目前筛选到的能用于特异性捕获细菌的适配体种类较少；抗生素的价格低，稳定性高，能特异性吸附细菌，但是抗生素是小分子物质，对细菌的识别位点较少。抗体由于其高度特异性的抗原识别能力而成为目前常用的平台。传统基于抗体的测定法，诸如ELISA、凝集试验和探针测试是其广泛使用的方法。然而，因为一些测定法的低灵敏度，这些实验需要较长的富集时间。尽管ELISA的灵敏度相对较高，其仍需要较长的测定时间，并包括费力的程序。此外，ELISA测定法很昂贵，因为它们需要昂贵的仪器和高质量的纯化抗原。抗菌肽具有价格低、性质稳定的优点，对细菌也具有特异性吸附能力，抓取细菌时具有更多的识别位点。目前，现有的检测方法是将肽与信号标记物(如荧光团、酶和纳米颗粒)结合或将肽固定在载体表面(如磁珠、载玻片、石墨烯和金电极)。然而，这些方法需要抗菌肽的化学基团衍生化以结合载体或化学修饰以标记信号标记物。这些方法消耗大量试剂，价格昂贵，并且制备过程过于复杂。如果采用不恰当的固定化方案，抗菌肽活性还可能会受到损害。
技术实现思路
为了解决现有致病性细菌检测方法存在的上述诸多问题，本专利技术提供一种基于双纳米复合物的比色免疫传感器及其制备方法和应用，用于简单、快速地检测大肠杆菌O157:H7。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的基于双纳米复合物的比色免疫传感器，包括：Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物；Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物。作为优选的实施方式，所述Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物由Fe3O4、大肠杆菌抗体、PBS缓冲液、硫酸铜溶液制成。作为优选的实施方式，所述Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物由高铁血晶素Hemin、抗菌肽MagaininI、PBS缓冲液、硫酸铜溶液制成。本专利技术的基于双纳米复合物的比色免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：步骤一、合成Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物；步骤二、合成Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物。作为优选的实施方式，步骤一具体包括以下步骤：(1)将25μL、40mg/mL的Fe3O4和40μL、0.1mg/mL的大肠杆菌抗体加入到800μL、10mM、pH7.4的PBS缓冲液中；(2)加入30μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至1mL，震荡混匀，在25℃下孵育14h；(3)10000转/分离心6min产生黑色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清，即得Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物。作为优选的实施方式，步骤二具体包括以下步骤：(1)将40μL、4mg/mL的高铁血晶素Hemin和40μL、1mg/mL的抗菌肽MagaininI加入到800μL、10mM、pH7.4的PBS缓冲液中；(2)加入20μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至1mL，混合均匀，在25℃下静置14h；(3)10000转/分离心6min产生褐色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清，即得Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物。本专利技术的基于双纳米复合物的比色免疫传感器的检测方法，包括以下步骤：步骤一、合成Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物；步骤二、合成Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物；步骤三、制备大肠杆菌O157:H7样品；步骤四、利用Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物和Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物对大肠杆菌O157:H7样品进行检测。作为优选的实施方式，步骤一具体包括以下步骤：(1)将25μL、40mg/mL的Fe3O4和40μL、0.1mg/mL的大肠杆菌抗体加入到800μL、10mM、pH7.4的PBS缓冲液中；(2)加入30μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至1mL，震荡混匀，在25℃下孵育14h；(3)10000转/分离心6min产生黑色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清，即得Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物。作为优选的实施方式，步骤二具体包括以下步骤：(1)将40μL、4mg/mL的高铁血晶素Hemin和40μL、1mg/mL的抗菌肽MagaininI加入到800μL、10mM、pH7.4的PBS缓冲液中；(2)加入20μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至1mL，混合均匀，在25℃下静置14h；(3)10000转/分离心6min产生褐色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清，即得Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物。作为优选的实施方式，步骤三和步骤四具体包括以下步骤：(1)将大肠杆菌O157:H7菌株在Luria-Bertani肉汤培养液中于37℃孵育过夜，4500rpm离心10min，PBS洗涤两次，并重悬于0.1mM、pH7.4的PBS中，将细菌悬浮液在PBS中连续稀释10倍；(2)将50μL不同浓度的大肠杆菌O157:H7悬浮液加入到离心管中，PBS缓冲液作阴性对照；(3)加入2μL的Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物，混合均匀，37℃下孵育1.5h，形成Fe3O4@Ab-E.coli纳米复合物；(4)用0.1mM、pH7.4的PBS洗涤三次，采用磁铁分离，以除去未结合的靶标；(5)加入8μL的Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物，37℃下孵育30min，以形成Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物-大肠杆菌O157:H7-Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物共轭夹心免疫复合物；(6)磁分离后，用0.1mM、pH8.0的PBS洗涤三次，以除去未结合的细菌细胞和非特异性结合部分，得到三明治式免疫复合物；(7)将10μL、10mM的ABTS和5μL、30mM的H2O2加入到三明治式免疫复合物中，混合均匀，反应5min，观察颜色变化和ABTS的吸光度的峰值，颜色变化、ABTS的吸光度与大肠杆菌O157:H7产生定量关系。专利技术原理：本专利技术使用Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物和Hemin@MI纳米酶磷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于双纳米复合物的比色免疫传感器，其特征在于，包括：/nFe

【技术特征摘要】
1.基于双纳米复合物的比色免疫传感器，其特征在于，包括：
Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物；
Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物。


2.根据权利要求1所述的基于双纳米复合物的比色免疫传感器，其特征在于，所述Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物由Fe3O4、大肠杆菌抗体、PBS缓冲液、硫酸铜溶液制成。


3.根据权利要求1所述的基于双纳米复合物的比色免疫传感器，其特征在于，所述Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物由高铁血晶素Hemin、抗菌肽MagaininI、PBS缓冲液、硫酸铜溶液制成。


4.如权利要求1至3中任意一项所述的基于双纳米复合物的比色免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、合成Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物；
步骤二、合成Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤一具体包括以下步骤：
(1)将25μL、40mg/mL的Fe3O4和40μL、0.1mg/mL的大肠杆菌抗体加入到800μL、10mM、pH7.4的PBS缓冲液中；
(2)加入30μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至1mL，震荡混匀，在25℃下孵育14h；
(3)10000转/分离心6min产生黑色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清，即得Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物。


6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤二具体包括以下步骤：
(1)将40μL、4mg/mL的高铁血晶素Hemin和40μL、1mg/mL的抗菌肽MagaininI加入到800μL、10mM、pH7.4的PBS缓冲液中；
(2)加入20μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至1mL，混合均匀，在25℃下静置14h；
(3)10000转/分离心6min产生褐色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清，即得Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物。


7.如权利要求1至3中任意一项所述的基于双纳米复合物的比色免疫传感器的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、合成Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物；
步骤二、合成Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物；
步骤三、制备大肠杆菌O157:H7样品；
步骤四、利用Fe3O4@Ab磷酸铜纳米复合物和Hemin@MI纳米酶磷酸铜纳米复合物对大肠杆菌O157:H7样品进行检测。

【专利技术属性】
技术研发人员：万家余，冷妍，何秀霞，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22