二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及检测方法技术

本发明专利技术涉及二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及检测方法。二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，包括单独存放的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体、酶标条、包被酶标条用二乙酸镳草镰刀菌烯醇‑半谷氨酸‑乳清蛋白偶联物、过氧化氢溶液、表面修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子和用于检测气压的气压检测传感器；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201881的杂交瘤细胞菌株DAS5G11E7产生。该方法具有灵敏度高、便携、廉价和易于操作等优点。

Competitive barometric immunosensor and detection method of Fusarium oxysporum diacetate enol

【技术实现步骤摘要】
二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及检测方法
本专利技术涉及二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及利用其检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量的方法。
技术介绍
二乙酸镳草镰刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol,DAS)又名蛇形毒素，属于单端孢霉烯毒素的一种，主要由梨孢镰孢霉、木贼镰孢霉和镳草镰孢霉等镰孢霉代谢所生。其主要污染谷物和饲料，其毒性较高，损害人类及动物骨髓等造血器官、脑与中枢神经细胞变性、淋巴结、睾丸与胸腺等。因此蛇形毒素污染是威胁农产品质量安全及农业产业发展的重大风险隐患。农产品生产涉及环节多，霉菌毒素污染不可避免，我国已对食品中的主要真菌毒素做了限量规定，但对于蛇形毒素并未做出限定。从而增加了农产品质量安全风险隐患。现有二乙酸镳草镰刀菌烯醇的检测方法主要是基于高效液相色谱等大型仪器的实验室确证性检测技术，样品处理复杂，不便于现场检测等不足。免疫学检测法是基于抗原-抗体特异性识别，通过酶、荧光等标记技术加以放大，从而定性或定量显示靶标物的含量。此类方法具有样品处理简单、灵敏度高、特异性强、实验周期短、适用于现场检测等优点。
技术实现思路
针对目前现有技术的不足，提供一种检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及检测方法。提供一种二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，包括单独存放的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体、酶标条、包被酶标条用二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物、过氧化氢溶液、表面修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子和用于检测气压的气压检测传感器；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C201881的杂交瘤细胞菌株DAS5G11E7产生。按上述方案，所述的金核铂壳纳米粒子粒径在10-150nm。按上述方案，所述的竞争型气压免疫传感器还包括橡胶条和放置酶标条的金属容器，金属容器上设有气压检测孔，酶标条放置于金属容器中，然后用橡胶条密封后，利用气压检测传感器检测体系压力。按上述方案，所述修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子的制备方法：将抗小鼠二抗添加到铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子中混匀，孵育一段时间后，加入封闭液封闭，获得表面修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子。封闭后的溶液离心去上清，用含有2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸的缓冲液保存培养，4℃贮存备用。按上述方案，羊抗鼠抗体修饰金核铂壳纳米粒子的时间为6-12h。按上述方案，羊抗鼠抗体的浓度范围为1-32μg/mL。一种利用上述二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器检测抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量的方法，包括以下步骤：将包被有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的酶标条加入样品提取液和抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体溶液，孵育，所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C201881的杂交瘤细胞菌株DAS5G11E7产生；加入经过羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子溶液，孵育，后处理；将后处理后的包被有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的酶标条加入过氧化氢溶液，保持一段时间，待过氧化氢反应产气完成后测量其气压值，基于气压值与二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量关系，分析获得二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量。按上述方案，所述的孵育条件为25-40℃，30min-2h。按上述方案，所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体溶液的浓度0.25-0.8ug/mL。按上述方案，待测样品加样量范围为20-100μL。按上述方案，产气反应时间范围为5-20min。按上述方案，所述的后处理为孵育完成后，弃去包被液，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗酶标条并甩干残余液体。按上述方案，在酶标条上包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的方法为：将酶标条加入到含有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的包被缓冲液中，25-40℃孵育1-4h，接着弃去包被液后，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗酶标条并甩干残余液体，得到包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的酶标条。按上述方案中，包被缓冲液为0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液。按上述方案中，二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的包被浓度范围为0.25-10μg/mL。使用时，将包被有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的酶标条加入样品提取液和抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体溶液，孵育，包被于酶标条上的二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物与待检测溶液中的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争结合抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的抗原表位，样品中的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量越多，与包被的二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物结合的抗体越少，从而与之结合的经过羊抗鼠(山羊抗小鼠)抗体修饰的金核铂壳粒子的量越少，因此单位时间内催化过氧化氢分解产生的氧气的量越少，从而在恒定体积内产生的气压值也越少。也就是说，所显示的气压值与样品中的二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量呈负相关。由此可实现二乙酸镳草镰刀菌烯醇的含量检测。本专利技术的优点在于：本专利技术二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器的信号方式由传统的酶联免疫放大改为金属催化放大方式，相对传统的酶联免疫放大，铂金属催化能力强信号放大能力强，同时基于高灵敏的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体，可实现微量甚至痕量检测IC50为4.16ng/mL,检测范围0.46-30.6ng/mL；基于气压检测的便携性，具有易于操作和可实现现场检测等特点。金核铂壳纳米粒子结构中铂和金纳米粒子具有生物相容性，可降低贵金属铂的用量，在保留原有强信号放大任你管理的同时兼顾了价格低廉的特点。附图说明图1为抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体在竞争型气压免疫传感检测的应用和方法的基本工作原理图，其中1金属溶液，2酶标条，3橡胶条，4便携式气压计；图2为二乙酸镳草镰刀菌烯醇和气压值的关系图。图3为本专利技术提供的二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体亲和力测定数据；图4(a)为本专利技术提供的二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体与其他真菌毒素交叉反应结果；(b)本专利技术提供的二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体建立的二乙酸镳草镰刀菌烯醇酶联免疫方法标准曲线。具体实施方式抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的获得抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生，制备方法为：将杂交瘤细胞株DAS5G11E7注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，其特征在于：包括单独存放的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体、酶标条、包被酶标条用二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物、过氧化氢溶液、表面修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子和用于检测气压的气压检测传感器；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201881的杂交瘤细胞菌株DAS5G11E7产生。/n

【技术特征摘要】
1.一种二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，其特征在于：包括单独存放的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体、酶标条、包被酶标条用二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物、过氧化氢溶液、表面修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子和用于检测气压的气压检测传感器；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C201881的杂交瘤细胞菌株DAS5G11E7产生。


2.根据权利要求1所述的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，其特征在于：其特征在于：所述的金核铂壳纳米粒子粒径在10-150nm。


3.根据权利要求1所述的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，其特征在于：还包括橡胶条和放置酶标条的金属容器，金属容器上设有气压检测孔，酶标条放置于金属容器中，然后用橡胶条密封后，利用气压检测传感器检测体系压力。


4.根据权利要求1所述的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，其特征在于：所述修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子的制备方法：将抗小鼠二抗添加到铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子中混匀，孵育一段时间后，加入封闭液封闭，获得表面修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子。


5.根据权利要求4所述的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，其特征在于：羊抗鼠抗体修饰金核铂壳纳米粒子的时间为6-12h；羊抗鼠抗体的浓度范围为1-32μg/mL。


6.一种利用上述二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器检测抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量的方法，其特征在于：包括以下...

【专利技术属性】
技术研发人员：张兆威，唐晓倩，王督，张奇，李培武，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42