二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒。它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的荧光试纸条包括衬板，衬板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线上包被二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原(DAS‑OVA)。可准确、快速的测定二乙酰镳草镰刀菌烯醇含量。

Flow lag immunotime-resolved fluorescence velocity test kit of Fusarium diacetalyticum enol

【技术实现步骤摘要】
二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒
本专利技术属真菌毒素检测领域，具体涉及二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后时间分辨荧光速测试剂盒。
技术介绍
真菌毒素(mycotoxins)是真菌在生长过程中产生的有毒次生代谢产物，真菌毒素通常是低分子物质，而且绝大多数真菌毒素都属热稳定物质。从霉菌毒素被发现以来，已经确认的真菌毒素大约有300多种之多，其中镰刀菌毒素具有毒性强和污染频率高的特点，单端孢霉烯族化合物又是镰刀菌毒素中污染水平较高，危害较大的一类。单端孢霉毒素分为A和B两类，二乙酰镳草镰刀菌烯醇属于单端孢霉毒素A类。二乙酰镳草镰刀菌烯醇急性毒性较强，对大鼠的LD50为0.75mg/kg，热稳定性也较强，一般烹调手段不能破坏毒素。中毒后临床表现为严重的皮炎、恶心、呕吐、血性腹泻、骨髓造血系统损害、神经系统紊乱、厌食和死亡。鉴于其危害作用及其在粮食和饲料中的广泛发生，世界各国对其含量进行了严格限定。随着生活水平的不断提高，人们对食品质量安全的要求越来越高。为了提高我国食品质量安全水平，更大程度的满足人们的安全消费需求，应加强对粮食中二乙酰镳草镰刀菌烯醇的监测，开发准确、高效的检测技术。目前真菌毒素的检测方法主要是仪器分析法和免疫分析法。仪器分析法如高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高等不足，难以实现快速检测。免疫分析法是以抗原与抗体的特异性识别作用和可逆性结合反应为基础的分析方法，该方法具有很高的选择性和灵敏度，与仪器分析法相比大大简化缩短样品处理时间，节约了检测成本。时间分辨荧光免疫分析(TRFICA)利用铕作为高亲和力探针，具有灵敏度高、性质稳定、避免荧光背景的干扰，检测时间短等优点，非常适合开发农药残留快速检测方法。因此开发一种二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，具有很大的必要性和十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒。二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的荧光试纸条包括衬板，衬板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线上包被二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原(DAS-OVA)；所述的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生。所述的杂交瘤细胞株DAS5G11E7于2018年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO.C201881。按上述方案，所述铕标记的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体是按照以下方法制得：将抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体用碳酸盐缓冲溶液透析后和铕标记试剂以质量比为0.5～2:1的比例充分混匀后静置过夜，然后经SephadexG-50层析柱分离铕标记的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体，洗脱，收集目标产物。按上述方案，所述荧光试纸条中的吸水垫长15～20mm，宽3～4mm；检测垫长25～30mm，宽3～4mm；样品垫长12～18mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。按上述方案，所述荧光试纸条中检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，质控线和检测线的间距为5～10mm；所述的样品反应瓶为1～5mL的卡口瓶。按上述方案，所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原包被量480～1000ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量100～900ng；所述样品反应瓶中铕标记的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体冻干品的含量0.2～1.0ug.按上述方案，所述的荧光试纸条是采用以下方法获得的：(1)将吸水纸剪裁成所需大小得吸水垫；(2)检测垫的制备：将二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原(DAS-OVA)配制成浓度为0.125～0.8mg/mL的DAS-OVA抗原包被液，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，然后于37～40℃条件下干燥30～60分钟；将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度0.1～1.0mg/mL的包被液，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，然后于37～40℃条件下干燥30～60分钟；(3)样品垫的制备：将玻璃纤维膜放入封闭液中完全浸湿，取出后于37～40℃条件下干燥3～6小时，得所需样品垫，置干燥器中室温保存；(4)荧光试纸条的组装：依次将吸水垫、检测垫、样品垫粘贴在衬板的一面，相邻各垫在连接处交叠连接即得荧光试纸条。按上述方案，所述荧光试纸条的制备中配制二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原(DAS-OVA)包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，氯化钠0.08g，氯化钾0.002g，叠氮化钠0.002g，十二水磷酸氢二钠0.029g，磷酸二氢钾0.002g；配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有氯化钠0.08g，氯化钾0.002g，叠氮化钠0.002g，十二水磷酸氢二钠0.029g，磷酸二氢钾0.002g；所述荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL中含有卵清白蛋白0.5～2g，蔗糖1～2g，氯化钠0.8g，氯化钾0.02g，叠氮化钠0.02g，十二水磷酸氢二钠0.29g，磷酸二氢钾0.02g。按上述方案，所述二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒还包括样品稀释液及样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01～0.30％的吐温20水溶液。上述二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒在二乙酰镳草镰刀菌烯醇含量检测中的应用：将待测样品液加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应6～10分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光试纸条上检测线(T)荧光强度值和质控线(C)荧光强度值的比值；基于预先获得的荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与二乙酰镳草镰刀菌烯醇浓度的关系曲线，获得待测样品液中二乙酰镳草镰刀菌烯醇的含量。按上述方案，所述的荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与二乙酰镳草镰刀菌烯醇浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：(1)配制得到一系列浓度梯度的二乙酰镳草镰刀菌烯醇标准品溶液；(2)将适量上述各浓度的二乙酰镳草镰刀菌烯醇标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应6分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的荧光试纸条包括衬板，衬板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线上包被二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原DAS-OVA；所述的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生。/n

【技术特征摘要】
1.二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的荧光试纸条包括衬板，衬板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线上包被二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原DAS-OVA；所述的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生。


2.根据权利要求1所述的二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：所述铕标记的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体是按照以下方法制得：将抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体用碳酸盐缓冲溶液透析后和铕标记试剂以质量比为0.5～2:1的比例充分混匀后静置过夜，然后经SephadexG-50层析柱分离铕标记的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体，洗脱，收集目标产物。


3.根据权利要求1所述的二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：所述荧光试纸条中的吸水垫长15～20mm，宽3～4mm；检测垫长25～30mm，宽3～4mm；样品垫长12～18mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。


4.根据权利要求1所述的二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：所述荧光试纸条中检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，质控线和检测线的间距为5～10mm；所述的样品反应瓶为1～5mL的卡口瓶。


5.根据权利要求1所述的二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原包被量480～1000ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量100～900ng；所述样品反应瓶中铕标记的抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体冻干品的含量0.2～1.0μg。


6.根据权利要求1所述的二乙酰镳草镰刀菌烯醇流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒，其特征在于：所述的荧光试纸条是采用以下方法获得的：
(1)将吸水纸剪裁成所需大小得吸水垫；
(2)检测垫的制备：
将二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原DAS-OVA配制成浓度为0.125～0.8mg/mL的DAS-OVA抗原包被液，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，然后于37～40℃条件下干燥30～60分钟；将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度0.1～1.0mg/mL的包被液，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，然后于37～40℃条件下干燥30...

【专利技术属性】
技术研发人员：张奇，唐晓倩，白艺珍，张文，李培武，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42