一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及曲霉半乳甘露聚糖检测技术领域，具体涉及一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒及其应用。包括由检测样品渗透方向依次设有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述胶体金垫上具有偶联抗曲霉菌特异抗体的荧光微球，所述硝酸纤维素膜上具有抗曲霉菌特异抗体检测段。包括以下步骤：将含有曲霉半乳甘露聚糖的样品液经过滤后与偶联抗曲霉菌特异抗体的荧光微球结合；再将抗体抗原免疫复合物与抗曲霉菌特异抗体检测段结合；用时间分辨荧光分析仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系中曲霉半乳甘露聚糖的浓度。通过设置样品垫能够吸收杂质过滤曲霉半乳甘露聚糖聚糖的作用，待检样本免于复杂预处理。

A detection kit for Aspergillus galactomannan and its application

【技术实现步骤摘要】
一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及曲霉半乳甘露聚糖检测
，具体涉及一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒及其应用。
技术介绍
对于当下的侵袭性真菌体外诊断市场，诊断产品主要以ELISA法检测试剂盒为代表。以BioRad公司的曲霉半乳甘露聚糖检测产品为例，该试剂盒采用夹心法，检测样本只能是患者血清。检测过程中，需要在样品中加入处理液并进行高温热处理、离心等预处理步骤。之后需要将经处理的样品和酶标抗体混合加入预先包被捕获抗体的微孔板中孵育1.5h，之后洗板5次，再加入底物显色30min，终止反应之后才能进行检测读数。读数数值与样品中待测物浓度呈正相关。该检测方法总时间大于3h，并且存在预处理麻烦和灵敏度较低的弊端，此外，该方法采用同一个IgM抗体进行夹心法，试剂盒稳定性较差，且为定性检测产品；其次，该方法根据检测OD值的比值进行结果判读，检测范围较小。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足和缺陷，提供一种检测样本免于预处理，检测时间短，灵敏度高，可定量的曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒及其应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒，包括由检测样品渗透方向依次设有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述胶体金垫上具有偶联抗曲霉菌特异抗体的荧光微球，所述硝酸纤维素膜上具有抗曲霉菌特异抗体检测段。其中样品垫用以吸收杂质并且过滤曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测样本，胶体金垫用以将曲霉半乳甘露聚糖与偶联抗曲霉菌特异抗体的荧光微球进行结合，形成抗体抗原免疫复合物，硝酸纤维素膜接受胶体金垫上的抗体抗原免疫复合物和胶体金垫上的偶联鼠单克隆抗体的荧光微球，其中抗体抗原免疫复合物和硝酸纤维素膜上的抗曲霉菌特异抗体检测段结合，偶联鼠单克隆抗体的荧光微球和抗鼠IgG的特异性抗体检测段结合形成免疫复合物；免疫复合物用以判断偶联鼠单克隆抗体的荧光微球是否与抗曲霉菌特异抗体检测段结合，当吸水垫用以吸附多余的检测样品。具体的，所述样品垫下游端搭接在胶体金垫上，所述胶体金垫下游端和所述吸水垫上游端搭接在硝酸纤维素膜上。样品垫下游搭接在胶体金垫上能够更加快速有效的吸收和引流检测样本。样品垫依照检测样品渗透方向开始渗透的为样品垫上游端，最后渗透的为下游端，胶体金垫和吸水垫也为同理，将样品垫下游端搭接在胶体金垫上更加有利于样品垫的渗透和过滤，胶体金垫下游端搭接在硝酸纤维素膜上更加有利于硝酸纤维素膜吸附胶体金垫上的抗体抗原免疫复合物和偶联鼠单克隆抗体的荧光微球，加快检测速度，当检测样品过多时通过吸水垫搭接在上游端搭接硝酸纤维素膜上能够更加快速的吸收多余检测样品。具体的，还包括底板，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从左到右依次设置在底板上，上述结构检测样品通常是从左向右渗透。具体的，还包括底板，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫由中心向四周依次设置在底板上，上述检测结构是由中心向四周渗透。具体的，所述底板由样品垫放置区向吸水垫放置区倾斜向下设置。通过倾斜设置能够使得检测样品更加快速的渗透至硝酸纤维素膜区，提高了检测速率。具体的，所述样品垫完全叠加在所述胶体金垫上。进一步当检测样品需要进入胶体金垫时受到重力的作用会完全被样品垫过滤进入胶体金垫区，达到充分过滤的效果。具体的，所述胶体金垫上还具有偶联鼠单克隆抗体的荧光微球，所述硝酸纤维素膜粘贴区上还具有抗鼠IgG的特异性抗体检测段，所述抗鼠IgG的特异性抗体检测段相较于抗曲霉菌特异抗体检测段更靠近吸水垫。偶联鼠单克隆抗体的荧光微球和曲霉半乳甘露聚糖与偶联抗曲霉菌特异抗体的荧光微球结合成的抗体抗原免疫复合物一起进入硝酸纤维素膜粘贴区，曲霉半乳甘露聚糖与偶联抗曲霉菌特异抗体的荧光微球结合成的抗体抗原免疫复合物与抗曲霉菌特异抗体检测段结合作为实验组，偶联鼠单克隆抗体的荧光微球与抗鼠IgG的特异性抗体检测段进行结合作为实验组的对照组，当检测出曲霉半乳甘露聚糖含量比较低时，如果对照组未形成免疫复合物，则说明为检测样品中曲霉半乳甘露聚糖含量较少或样本没有进入硝酸纤维素膜区，检测结果不准确，当对照组形成免疫复合物，则说明为检测样品含量达标，结果准确。偶联鼠单克隆抗体是通过以下方法进行制备：1)微球更换缓冲液：取1.5mLEP管，加入100μL空载微球，补加400μLMES缓冲液，混匀，10℃温度下，20000～30000g转速下离心10～20min，弃上清，微球沉淀分别加入500μLMES缓冲液，移液器吹吸混匀，再用超声破碎机超声分散3～5min；2)微球活化：微球溶液一边振荡一边逐滴加入200～300μgEDC，再一边振荡一边逐滴加入5-10μL的10mg/mLSulfo-NHS溶液，锡箔纸包裹避光，室温旋转仪40r/min活化15-20min；3)微球洗涤：10℃温度下，20000～30000g转速下离心10～20min，弃上清，微球沉淀加入500μLHEPES缓冲液，移液器吹吸混匀，再用超声破碎机超声分散3～5min；4)微球标记：将微球溶液中一边振荡一边逐滴加入0.1mg抗体，锡箔纸包裹避光，室温旋转仪40-60r/min反应120±20min；5)微球封闭：微球中加入55μL封闭液，锡箔纸包裹避光，室温旋转仪40-60r/min反应120±20min；6)微球洗涤：10℃温度下，转速为20000～30000g转速下离心10～20min，弃上清，微球沉淀加入1mLHEPES缓冲液，移液器吹吸混匀。再重复上述洗涤操作，共洗涤两遍；最后沉淀重悬在200μL偶联储存液中。用超声破碎机超声分散3～5min，置于4℃冰箱避光保存，完成制备。曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒在曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测上的应用，包括以下步骤：1)将含有曲霉半乳甘露聚糖的样品液经过滤后与偶联抗曲霉菌特异抗体的荧光微球结合，形成抗体抗原免疫复合物；2)再将抗体抗原免疫复合物与抗曲霉菌特异抗体检测段结合，形成最终产物；3)用时间分辨荧光分析仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系中曲霉半乳甘露聚糖的浓度。具体的，在步骤2)中，还有偶联鼠单克隆抗体的荧光微球与抗鼠IgG的特异性抗体检测段进行结合。本专利技术相比现有技术包括以下优点及有益效果：(1)本专利技术通过设置样品垫能够吸收杂质过滤曲霉半乳甘露聚糖聚糖的作用，待检样本免于复杂预处理，样本可以直接进行检测；通过偶联抗曲霉菌特异抗体的荧光微球与曲霉半乳甘露聚糖聚糖结合进行检测，大大拓展了样本检测范围，本产品可以检测血清、血浆、脑脊液、尿液、胸腔积液及肺泡灌洗液等。(2)本专利技术是通过时间分辨免疫荧光层析法的原理对曲霉半乳甘露聚糖聚糖进行检测，其检测时间相较于夹心法时间更短，灵敏度更高。本专利技术通过采用两个特异鼠单克隆抗体进行反应，抗体亲和力较高，且消除单一抗体互相竞争的情况，能够实现无需前处理即可检测。能够在10min内实现检测，大大缩短了产品检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒，其特征在于：包括由检测样品渗透方向依次设有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述胶体金垫上具有偶联抗曲霉菌特异抗体的荧光微球，所述硝酸纤维素膜上具有抗曲霉菌特异抗体检测段。/n

【技术特征摘要】
1.一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒，其特征在于：包括由检测样品渗透方向依次设有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述胶体金垫上具有偶联抗曲霉菌特异抗体的荧光微球，所述硝酸纤维素膜上具有抗曲霉菌特异抗体检测段。


2.根据权利要求1所述的一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒，其特征在于：所述样品垫下游端搭接在胶体金垫上，所述胶体金垫下游端和所述吸水垫上游端搭接在硝酸纤维素膜上。


3.根据权利要求2所述的一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒，其特征在于：还包括底板，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从左到右依次设置在底板上。


4.根据权利要求2所述的一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒，其特征在于：还包括底板，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫由中心向四周依次设置在底板上。


5.根据权利要求3或4所述的一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒，其特征在于：所述底板由样品垫放置区向吸水垫放置区倾斜向下设置。


6.根据权利要求3或4所述的一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒，其特征在于：所述样品垫完全叠加在所述胶体金垫上。


7.根据权利要求1-4任一项所述的一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金垫上还具有偶联鼠单克隆抗体的荧光微球，所述硝酸纤维素膜粘贴区上还具有抗鼠IgG的特异性抗体检测段，所述抗鼠IgG的特异性抗体检测段相较于抗曲霉菌特异抗体检测段更靠近吸水垫。


8.根据权利要求7所述的一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒，其特征在于：偶联鼠单克隆抗体是通过以下方法进行制备：
1)微球更换缓冲液：取1.5mLEP管，加入100μL空载微球，补加400μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李嗣乾，王勇，
申请(专利权)人：深圳华瑞达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44