游离前列腺特异性抗原检测试剂盒及其制备方法技术

本申请涉及一种游离前列腺特异性抗原检测试剂盒及其制备方法。试剂盒包括第一试剂、第二试剂，可选地还包括质控品和/或校准品。第一试剂包含表面活性剂和缓冲液，第二试剂包含包被有抗体的纳米颗粒和缓冲液。该试剂盒利用样本中的游离前列腺特异性抗原与第二试剂中的抗体反应。样本中游离前列腺特异性抗原浓度越高，抗体与包被有抗体的纳米颗粒反应产生的浊度变化越大，由此可建立校准曲线，从而定量测定未知样本中游离前列腺特异性抗原浓度。

Free prostate specific antigen detection kit and its preparation

【技术实现步骤摘要】
游离前列腺特异性抗原检测试剂盒及其制备方法
本申请属于临床体外诊断、医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂。更进一步地，本申请涉及一种fPSA检测试剂盒。
技术介绍
人前列腺特异抗原(ProstateSpecificAntigen，以下简称PSA)是由前列腺腺泡和导管的上皮细胞分泌的一种单链糖蛋白，分子量约34KD。PSA在功能上属于类激肽释放酶的一种丝氨酸蛋白酶，参与精液的液化过程，是临床常规用于前列腺良性与恶性疾病的诊断、鉴别、前列腺癌患者术后随访的重要指标。正常生理情况下，PSA通过导管分泌到精液中。PSA在精液中的浓度高于在血清中浓度的100万倍。在前列腺的腺泡、导管腔与血液循环系统之间，存在着明显的组织屏障。当患有前列腺疾病时，组织屏障就会受到不同程度的破坏。特别是患有前列腺癌时，由于肿瘤细胞的异常生长会使这一自然屏障遭受严重破坏，PSA就会大量渗漏于血中，造成血清PSA水平的大幅度升高。研究证明，血循环中PSA以两种形式存在：结合型PSA(cPSA)大约占85％以上，游离型PSA(即fPSA)占15％左右，两者之和为总PSA(tPSA)。临床中，通常把tPSA>4ng/ml作为筛选前列腺癌的临界值；把tPSA结果在4至10ng/ml之间称为灰色区域，前列腺癌与前列腺增生均有可能；而当tPSA>10ng/ml时，前列腺癌可能性极大。对于fPSA/tPSA比值，各文献报道不一致。有些以0.16为临界值，也有以0.19或0.25为临界值。当血清tPSA在灰色区域时，fPSA/tPSA显得非常重要，fPSA/tPSA大于临界值时，前列腺癌的可能性小，当fPSA/tPSA值小于临界值时，前列腺癌的可能性较大。随着医疗专业人员和患者意识到fPSA在诊断前列腺癌的潜在价值，实验室检验量激增，需要本领域提供更快、更准、更有效的检测方法，帮助医生和患者更早的得到检测结果。目前fPSA通常用免疫学方法进行测定。常用检测方法有：(1)化学发光免疫定量检测，本法采用全自动控制系统，以吖啶酯标记法，微磁性颗粒PSA结合的固相试剂和单抗PSA液相试剂，直接发光进行定量检测的技术。该技术灵敏度高、特异性强，但仪器、试剂昂贵，无法基层筛查；(2)酶标测定法(EIA)，通常采用双抗夹心法对f-PSA、c-PSA、t-PSA进行测定。所采用的抗体为针对PSA上不同表位的单克隆抗体，采用的单克隆抗体不同，可以检测PSA的不同形式。该法缺点是重复性差，对操作人员素质要求较高；(3)放射免疫测定法(RIA)，存在环境污染问题；(4)金标记分析，该法具有使用方便、结果易读、反应迅速等优点，但准确性较差。本申请所要解决的问题是克服上述现有试剂所存在的缺陷，提供一种新的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒，检测样本中(例如血清或血浆)fPSA的含量，提高检测速度、降低操作复杂性、尽快得到可靠结果。
技术实现思路
根据本申请的一方面，提供了一种检测试剂，其包含第一抗体和第二抗体；所述第一抗体为抗-抗原抗体；所述第二抗体为抗-复合物抗体；并且所述第二抗体不单独结合所述的抗原，所述复合物是所述第一抗体和所述抗原形成的复合物。在一些实施方案中，所述抗原是人fPSA。在一些实施方案中，所述第一抗体为单克隆抗体或其抗原结合片段；所述第二抗体为抗原结合片段。单克隆抗体源自：鼠、兔、禽、羊、重组抗体。所述的抗原结合片段选自：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、单域抗体。根据本申请的另一方面，提供了一种fPSA检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂。在一些实施方案中，第一试剂包含表面活性剂和缓冲液。在一些实施方案中，第二试剂包含：-包被有第一抗体的第一纳米微球、-包被有第二抗体的第二纳米微球、和-缓冲液。在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液各自独立地选自：磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液(也作2-吗啉乙磺酸缓冲液)、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液和氯化铵缓冲液中的一种或更多种。在一些实施方案中，缓冲液浓度为10-500mM，浓度优选20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、以及前述任意两个数值之间的范围；作为示例，缓冲液浓度为20mM、30mM、40mM、50mM、以及前述任意两个数值之间的范围。在一些实施方案中，缓冲液的pH值为6至8，作为示例，pH是7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5以及前述任意两个数值之间的范围。在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型可以相同也可以不同。在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度可以相同也可以不同。在一些优选实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型相同；且第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度不同。在一个具体实施方案中，第一试剂的缓冲液是50mMHEPES缓冲液；在一个具体实施方案中，第二试剂的缓冲液是20mM甘氨酸缓冲液。本领域技术人员可以理解，随着缓冲液类型、浓度等因素，缓冲液的pH值可以有所不同。在一些实施方案中，所述的第一抗体为单克隆抗体或其抗原结合片段；所述的第二抗体为抗原结合片段。单克隆抗体源自：鼠、兔、禽、羊、重组抗体。抗原结合片段选自：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、单域抗体。在具体的实施方案中，所述的第二抗体不建议采用分子量较大的完整的单克隆抗体。在具体的实施方案中，所述的第二抗体是分子量比单克隆抗体小的抗原结合片段，例如单域抗体(源自骆驼科动物的抗体，例如羊驼)。在一些具体的实施方案中，所述第二抗体通过间隔臂分子连接至所述第二纳米微球。间隔臂分子是戊二醛或惰性载体蛋白。惰性载体蛋白选自：血清白蛋白、甲状腺球蛋白、铜蓝蛋白、卵蛋白、多聚赖氨酸。在一些具体的实施方案中，当第一抗体是单克隆抗体时，第二抗体是单域抗体。在另一些具体的实施方案中，当第一抗体是抗原结合片段时，第二抗体是抗原结合片段(段选自：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、单域抗体)。在一些实施方案中，第一试剂包含选自如下的一种或更多种：-0.1至0.5MNaCl、-0.05至0.2％(w/v)防腐剂、-0.05至0.2％(w/v)BSA、-0.5至2％(w/v)PEG2000-PEG80000(例如6000)、和-0.1％-0.5％(w/v)AEO7。应当理解，尽管本申请中公开了试剂中各个组分的具体浓度，技术人员允许将试剂制备成不同的浓缩或稀释形式，因此试剂的浓缩和稀释形式仍然落入本申请的范畴。根据需要，根据本申请的fPSA检测试剂盒还包括质控品和/或校准品。校准品主要用于校准测量系统、评价测量程序或为待测样本赋值。因此，所述校准品包含已知浓度的fPSA，校准品的值甚至可以追溯至参考本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，其包含：/n第一试剂，/n第二试剂；和/n任选地，质控品和/或校准品；/n其中，/n所述第一试剂包含：/n-表面活性剂、和/n-缓冲液；/n所述第二试剂包含：/n-包被有第一抗体的第一纳米微球、/n-包被有第二抗体的第二纳米微球、和/n-缓冲液；/n所述校准品包含已知浓度的人fPSA；/n所述质控品包含已知浓度的人fPSA；/n所述第一抗体为抗人fPSA抗体；/n所述第二抗体为抗复合物抗体，且所述第二抗体不单独结合人fPSA；所述复合物是所述第一抗体和人fPSA形成的复合物；/n所述第一试剂和第二试剂中的缓冲液独立地选自以下的一种或组合：磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液；/n所述第一试剂和第二试剂中缓冲液的浓度独立地为10mM至500mM，优选20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM；/n所述第一试剂和第二试剂中缓冲液的pH独立地为6至8，优选7.0至7.5。/n

【技术特征摘要】
1.一种游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，其包含：
第一试剂，
第二试剂；和
任选地，质控品和/或校准品；
其中，
所述第一试剂包含：
-表面活性剂、和
-缓冲液；
所述第二试剂包含：
-包被有第一抗体的第一纳米微球、
-包被有第二抗体的第二纳米微球、和
-缓冲液；
所述校准品包含已知浓度的人fPSA；
所述质控品包含已知浓度的人fPSA；
所述第一抗体为抗人fPSA抗体；
所述第二抗体为抗复合物抗体，且所述第二抗体不单独结合人fPSA；所述复合物是所述第一抗体和人fPSA形成的复合物；
所述第一试剂和第二试剂中的缓冲液独立地选自以下的一种或组合：磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液；
所述第一试剂和第二试剂中缓冲液的浓度独立地为10mM至500mM，优选20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM；
所述第一试剂和第二试剂中缓冲液的pH独立地为6至8，优选7.0至7.5。


2.根据权利要求1所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，其中：
所述的第一抗体为单克隆抗体或其抗原结合片段；
所述的第二抗体为抗原结合片段；
所述的单克隆抗体源自：鼠、兔、禽、羊、重组抗体；
所述的抗原结合片段选自：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、单域抗体；
优选地，所述第二抗体通过间隔臂分子连接至所述第二纳米微球；
所述间隔臂分子是戊二醛或惰性载体蛋白；
所述惰性载体蛋白选自：血清白蛋白、甲状腺球蛋白、铜蓝蛋白、卵蛋白、多聚赖氨酸。


3.根据权利要求1所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，其中所述的表面活性剂选自以下的一种或组合：脂肪醇聚氧乙烯醚、吐温20、Brij；
优选，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自以下的一种或组合：AEO7、AEO9、AEO3；
所述的表面活性剂浓度为按w/v计0.01％至3％。


4.根据权利要求1所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，其中：
所述的纳米微球是由选自以下中的一种或更多种聚合而成：聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸酯；
所述的纳米微球的平均粒径为400nm至500nm，优选450nm；
任选地，所述第一试剂还包含以下的一种或组合：
按w/v计0.05至0.2％稳定剂、
按w/v计0.05至0.2％防腐剂、
0.1至0.5M盐离子、
按w/v计0.5至2％PEG；
优选地，所述校准品包含：0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml或10ng/mlfPSA、缓冲液、稳定剂、防腐剂。


5.一种纳米微球的制备方法，所述方法包括步骤：
第一步骤，其包括：
1.1)将第一纳米微球进行活化，得到活化的纳米微球；
1.2)将第一抗体偶联至所述活化的纳米微球，得到第一抗体-纳米微球偶联物；
1.3)对步骤1.2)得到的第一抗体-纳米微球偶联物进行封闭，
第二步骤，其包括：
2.1)任选，将第二抗体与间隔臂分子进行交联，得到第二抗体与间隔臂分子的复合物；
2.2)将所述第二抗体或将步骤2.1)所得复合物偶联至第二纳米微球，得到第二抗体-纳米微球偶联物；
2.3)对步骤2.2)得到的第二抗体-纳米微球偶联物进行封闭，
第三步骤：将所述第一抗体-纳米微球偶联物和所述第二抗体-纳米微球偶联物混合，
其中所述第一步骤和所述第二步骤的顺序是并行的、或者能够互换的；
所述第一抗体为抗人fPSA抗体；
所述第二抗体为抗复合物抗体，且所述第二抗体不单独结合人fPSA；所述复合物是所述第一抗体和人fPSA形成的复合物。


6.根据权利要求5所述的纳米微球的制备方法，其中，
所述的纳米微球是由选自以下中的一种或更多种聚合而成：聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸酯；
所述纳米微球的平均粒径为400nm至500nm，优选450nm；
优选，所述第一纳米微球是羧基修饰的纳米微球，
优选，所述第二纳米微球是氨基修饰的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小锐，张晶晶，蔡华雅，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11