一种包被蛋白的氨基微球及其制备方法与血管紧张素I检测试剂盒技术

一种包被蛋白的氨基微球及其制备方法与应用与血管紧张素I测定试剂盒，属于固相试剂技术领域。解决了现有制备包被蛋白的微球的方法中，存在的蛋白与微球之间的有效结合度有限、偶联效率低、工艺复杂、成本高的问题。本发明专利技术的制备方法，步骤如下：先将氨基微球与活化剂分别溶于pH为4.5的缓冲液中；然后将得到的含有氨基微球的缓冲液与含有活化剂的缓冲液混合，活化，得到含有活化微球的溶液；然后加入蛋白，偶联，得到含有蛋白偶联活化微球的溶液；再加入pH为8.5缓冲液反应，反应完成后，加入封闭剂封闭，即得包被蛋白的氨基微球。该制备方法大大提高了化学偶联的效率，同时操作更加简单，成本更加低廉。

An amino microspheres coated with protein and its preparation and detection kit for Angiotension I

【技术实现步骤摘要】
一种包被蛋白的氨基微球及其制备方法与血管紧张素I检测试剂盒
本专利技术属于血管紧张素I检测
，具体涉及一种包被蛋白的氨基微球及其制备方法与血管紧张素I检测试剂盒。
技术介绍
高血压是最常见的心血管病，是全球范围内的重大公共卫生问题。高血压可导致脑血管、心脏、肾脏的病变，是危害人类健康的主要疾病。我国现有高血压患者2亿多人，而世界各地的患病率高达10％～20％。随着经济发展，人民生活水平的提高，高血压已日益成为一种世界性的常见疾病。血管紧张素Ⅰ(AngiotensinI，AngI)是血管紧张素转化过程中的一种中间产物，它是血管紧张素原(Angiotensinogen)经肾素(Renin)作用水解产生的一种十肽，其收缩血管的活性很弱，必须经肺脏转换酶的作用成为血管紧张素Ⅱ，才会有明显的活性。血管紧张素II能使全身小动脉收缩而升高血压，此外，还可以促进肾上腺皮质分泌醛固酮，醛固酮作用于肾小管，起保钠、保水、排钾作用，从而引起血量增多，血压升高。正常情况下，由于肾素分泌很少，血中血管紧张素也少，对血压调节不起明显作用。但当失血过多时，由于动脉血压显著下降使肾血流量减少，血管紧张素生成增多，对防止血压过度下降而使血压回升起重要作用。此外，血管紧张素可引起血管强烈收缩，但在正常情况下不参与血压调节。当机体处于失血等情况而使循环血量减少时，该激素在血中浓度将显著升高，对保持循环血量和维持动脉血压起一定作用。临床上血管紧张素I对高血压的诊断与分型，以及评估冠心病、心力衰竭等疾病的严重程度和预后都有重要意义。原发性高血压、特发性或假性醛固酮增多症、肾上腺癌、肾上腺皮质增多症激素合成缺陷等疾病会导致血管紧张素I降低；而继发性醛固酮增多症、肾功能减退、肾炎、充血性心力衰竭、肾血管瘤、分泌肾素的肾球旁器增生症、嗜铬细胞瘤、肝硬化等疾病会导致血管紧张素I升高。现有技术中，血管紧张素I一般通过胶乳增强免疫比浊法进行检测。胶乳增强免疫比浊法中，需采用物理或化学的方法将蛋白吸附或偶联到胶乳微球的表面，物理吸附法稳定性不理想，蛋白容易从微粒上脱落，且易受样本中干扰物质影响，造成测试结果不准确；化学偶联方法将蛋白可通过多种化学物质搭桥偶联到微球上，但这种方法蛋白与微球之间的有效结合度有限，偶联效率低，且工艺复杂、试剂成本也高。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术为解决现有技术制备包被蛋白的微球的方法中，存在的蛋白与微球之间的有效结合度有限、偶联效率低、工艺复杂、成本高的技术问题，提供一种蛋白包被的氨基微球及其制备方法与应用。本专利技术解决上述技术问题采取的技术方案如下。本专利技术提供一种包被蛋白的氨基微球的制备方法，步骤如下：步骤一、将氨基微球与活化剂分别溶于pH为4.5的缓冲液中，得到含有微球的缓冲液和含有活化剂的缓冲液；步骤二、将含有氨基微球的缓冲液与含有活化剂的缓冲液混合，活化，得到含有活化微球的溶液；步骤三、将蛋白加入到含有活化微球的溶液中，偶联60～90min，得到含有蛋白偶联活化微球的溶液；步骤四、再将pH为8.5的缓冲液加入到含有蛋白偶联活化微球的溶液中，反应，反应完成后，加入封闭剂封闭30min以上，即得包被蛋白的氨基微球。优选的是，所述步骤一中，氨基微球与活化剂的物质的量比为(40～100):1。优选的是，所述步骤一中，氨基微球为氨基磁珠，活化剂为戊二醛。优选的是，所述步骤二中，活化时间为30～90min。优选的是，所述步骤三中，蛋白与活化微球的质量比为(1～2):1，蛋白为血管紧张素I抗体。优选的是，所述步骤四中，反应时间为60min以上。优选的是，所述步骤四中，封闭剂为1％的牛血清蛋白或1％的明胶。优选的是，步骤四中，向包被蛋白的氨基微球中加入pH为8的缓冲液，并使用NaOH溶液调节pH至7.5，再加入保护剂，得到包被蛋白的氨基微球溶液。更优选的是，保护剂为0.2％的蔗糖或0.2％的聚乙烯呲咯烷酮。本专利技术还提供上述包被蛋白的氨基微球的制备方法制备的包被蛋白的氨基微球。本专利技术还提供一种血管紧张素I测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；R1试剂包括：磷酸盐缓冲液20～100mmol/L、牛血清白蛋白2～10g/L、Tween-201～5g/L、聚乙二醇5～30g/L、PC-3001g/L和包被蛋白的氨基微球0.05％～0.1％，所述包被蛋白的氨基微球中的蛋白为血管紧张素I抗体；R2试剂包括：磷酸盐缓冲液20～100mmol/L、牛血清白蛋白2～10g/L、蔗糖10～20g/L、PC-3001g/L和吖啶酯标记的血管紧张素I与蛋白的偶联物0.05～0.2μg/mL，所述偶联物中的蛋白为牛血清白蛋白。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术的包被蛋白的氨基微球的制备方法，采用梯度pH将蛋白与氨基微球进行化学偶联，将蛋白与氨基微球有效连接，提高蛋白与微球之间的有效结合，大大提高了化学偶联的效率，同时操作更加简单，成本更加低廉。本专利技术的血管紧张素I测定试剂盒检测效果明显。附图说明图1为本专利技术对比例1和实施例1中不同pH条件下蛋白(血管紧张素I)与氨基微球的偶联效率图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过具体实例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中描述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。本专利技术提供一种包被蛋白的氨基微球的制备方法，步骤如下：步骤一、将氨基微球与活化剂分别溶于pH为4.5的缓冲液中，得到含有微球的缓冲液和含有活化剂的缓冲液；步骤二、将含有氨基微球的缓冲液与含有活化剂的缓冲液混合，活化30～90min，得到含有活化微球的溶液；步骤三、将蛋白加入到含有活化微球的溶液中，偶联60～90min，得到含有蛋白偶联活化微球的溶液；步骤四、再将pH为8.5缓冲液加入到含有蛋白偶联活化微球的溶液中，反应60min以上，反应完成后，加入封闭剂封闭30min以上，即得包被蛋白的氨基微球。上述技术方案，步骤一中，微球与活化剂的物质的量比优选为(40～100):1。氨基微球优选为氨基磁珠，可采用本领域熟知方式获得，如商购(Thermo厂家)。活化剂优选为戊二醛。缓冲液没有特殊限制，主要起到溶解作用，优选为碳酸盐缓冲液。含有微球的缓冲液中氨基微球的浓度优选为10～50mg/mL，含有活化剂的缓冲液中活化剂的浓度优选为20wt％。上述技术方案，步骤二中，活化时间对效果没有影响，考虑生产效率，优选活化时间为30～90min，更优选为30min。上述技术方案，步骤三中，蛋白为血管紧张素I抗体，蛋白与活化微球的质量比为(1～2):1，偶联时间优选为60min。上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包被蛋白的氨基微球的制备方法，其特征在于，步骤如下：/n步骤一、将氨基微球与活化剂分别溶于pH为4.5的缓冲液中，得到含有微球的缓冲液和含有活化剂的缓冲液；/n步骤二、将含有氨基微球的缓冲液与含有活化剂的缓冲液混合，活化，得到含有活化微球的溶液；/n步骤三、将蛋白加入到含有活化微球的溶液中，偶联60～90min，得到含有蛋白偶联活化微球的溶液；/n步骤四、再将pH为8.5的缓冲液加入到含有蛋白偶联活化微球的溶液中，反应，反应完成后，加入封闭剂封闭30min以上，即得包被蛋白的氨基微球。/n

【技术特征摘要】
1.包被蛋白的氨基微球的制备方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、将氨基微球与活化剂分别溶于pH为4.5的缓冲液中，得到含有微球的缓冲液和含有活化剂的缓冲液；
步骤二、将含有氨基微球的缓冲液与含有活化剂的缓冲液混合，活化，得到含有活化微球的溶液；
步骤三、将蛋白加入到含有活化微球的溶液中，偶联60～90min，得到含有蛋白偶联活化微球的溶液；
步骤四、再将pH为8.5的缓冲液加入到含有蛋白偶联活化微球的溶液中，反应，反应完成后，加入封闭剂封闭30min以上，即得包被蛋白的氨基微球。


2.根据权利要求1所述的包被蛋白的氨基微球的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，氨基微球与活化剂的物质的量比为(40～100):1。


3.根据权利要求1所述的包被蛋白的氨基微球的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，氨基微球为氨基磁珠，活化剂为戊二醛。


4.根据权利要求1所述的包被蛋白的氨基微球的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，活化时间为30～90min。


5.根据权利要求1所述的包被蛋白的氨基微球的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，蛋白与活化微球的质量比为(1～2):1，蛋白为血管紧张素I抗体。


6.根据权利要求1所述的包被蛋白的氨基微球的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：高阳，唐仁陶，胡雪凇，孙成艳，高威，何浩会，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22