Au@HIF-1α aptamer@Au纳米酶的制备及在隐匿型冠心病检测中的应用制造技术

本发明专利技术报道了一种Au@HIF‑1αaptamer@Au纳米酶的制备及其在隐匿型冠心病血清外泌体中缺氧诱导因子‑1α(hypoxia inducible factor‑1，HIF‑1α)检测中的应用。首先以纳米金为核心，将巯基化的HIF‑1α适配体(HIF‑1αaptamer，其碱基序列为5’‑HS‑(CH

Preparation of Au @ HIF-1 \u03b1 aptamer @ Au nanoenzyme and its application in detection of latent coronary heart disease

【技术实现步骤摘要】
Au@HIF-1αaptamer@Au纳米酶的制备及在隐匿型冠心病检测中的应用
本专利技术涉及免疫分析领域，具体涉及一种Au@HIF-1αaptamer@Au纳米酶的制备及其在隐匿型冠心病血清外泌体HIF-1α检测中的应用。
技术介绍
隐匿型冠心病是无临床症状，但客观检查有心肌缺血表现的冠心病，亦称无症状性冠心病。病人有冠状动脉粥样硬化，但病变较轻或有较好的侧支循环，或病人痛阈较高因而无疼痛症状。它可能突然转为心绞痛或心肌梗塞，甚至直接猝死。因此尽早预警隐匿型冠心病患者，并及时开展早期的治疗，具有重要的临床意义和社会价值。缺氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1α)是一种在低氧环境中促细胞存活的转录因子，已成为冠心病的临床诊断的一项重要指标。由于HIF-1α在血清中不稳定，会发生不同程度的降解；而HIF-1α在正常人群血清中保持着稳定的表达量，隐匿型冠心病患者血清中HIF-1α的新增表达量在降解后不足以与正常组区分，这也是目前临床上隐匿型冠心病非影像学检测不可行的主要原因之一。外泌体中由于没有HIF-1α降解酶因而HIF-1α相对较稳定，因此通过监测外泌体中HIF-1α的含量有望成为隐匿型冠心病提前预警的一个重要方法。虽然商品化的ELISA试剂盒可以实现HIF-1α的测定，但是其检测限高于外周静脉血的外泌体中HIF-1α的表达水平，而无法满足临床实际检测需要，因此亟待开发更高灵敏度和更低检测限的分析方法，以实现正常人群与隐匿型冠心病患者的外周静脉血的外泌体中HIF-1α表达量的区分性检测。纳米酶与核酸适配体(Aptamer)的复合材料是近年来材料领域研究的热点。纳米酶作为一类具有独特类酶性质的纳米材料，可避免生物天然酶结构不稳定的困扰，省去了传统模拟酶工艺复杂性的麻烦，增添了生理温和条件下就可高效催化的便利，可以较低的成本进行大规模生产，具有工业应用的无限潜力。核酸适配体是一种经体外筛选技术-指数富集的配体系统进化技术，得到的结构化的寡核苷酸序列，不但与相应的靶标分子(蛋白质、病毒、细菌、细胞等)有严格的识别能力和高度的亲和力，而且价格低廉、易于合成、常温保存等诸多优势。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种Au@HIF-1αaptamer@Au核壳结构纳米酶的制备方法。该纳米酶具有的壳核结构，催化面积大，从而大大降低了HIF-1α的最低检测限；同时，基于纳米金壳的催化性能，可避免生物天然酶结构不稳定性，有助于材料的长期保存与使用。本专利技术的第二目的在于提供一种Au@HIF-1αaptamer@Au核壳结构纳米酶的应用，即用该纳米酶催化TMB/H2O2体系，进行血清外泌体中HIF-1α的检测，尽早预警隐匿型冠心病患者。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种Au@HIF-1αaptamer@Au纳米酶的制备及其在隐匿型冠心病检测中的应用，其技术路线示意图如图1所示，具体包括：(1)制备纳米金：将所有玻璃容器在王水中浸泡过夜后，再用含5％二氯二甲基硅烷的氯仿溶液浸泡5-30min并于室温晾干，最后用去离子水洗涤三次，烘干备用。取50mL0.05％～1％的HAuCl4溶液至锥形瓶中，搅拌加热至沸腾。随后迅速向其中加入5mL0.5％～5％柠檬酸钠溶液，待溶液呈酒红色后保持沸腾10-30min；最后停止加热，在搅拌下冷却至室温，用去离子水定容至50mL即得纳米金溶液，置于4℃备用；(2)制备Au@HIF-1αaptamer：将0.1mM的HIF-1αaptamer(碱基序列为5’-HS-(CH2)n-CCCACCCACCCATGTTGTTGTCTACGTGCT-3’)溶液与步骤(1)所得的纳米金溶液按照1:10～1：500的体积比混合，于室温下避光、温和搅拌4～16h；然后在温和搅拌下，向其中滴加50μL0.5MTris-acetate液(pH8.2)和500μL1MNaCl溶液，室温避光静置24h。最后，通过离心(16000g，20min)使产物完全沉积于EP管底部，并用Tris-acetate液洗涤两次后，再分散即得Au@HIF-1αaptamer溶液，置于4℃保存备用；(3)提取血清中的外泌体：全血不抗凝室温静置放置1h后离心(3000g，10min)，将所得上清液再次离心(3000g，10min)得到血清。将血清用PBS缓冲液1:1稀释后离心(10000g，30min)，将所得上清液用0.2μm微孔滤膜过滤，而后超速离心(100000g，70min)，将所得沉淀用PBS缓冲液洗涤一次后分散于PBS缓冲液中得到外泌体溶液，置4℃保存备用；(4)制备Au@HIF-1αaptamer@Au纳米酶：向HIF-1α抗体包被酶标板中加入50μL外泌体溶液样品，37℃孵育30min，随后向中加入50μL步骤(2)所得的Au@HIF-1αaptamer溶液，室温下继续孵育30min；在经PBS洗涤三次后，中加入100μL金加强液(5mMHAuCl4·4H2O溶液与10mMNH2OH·HCl溶液等体积混合)，28℃孵育20min；随后用PBS将其洗涤3次并拍干，即得Au@HIF-1αaptamer@Au核壳结构纳米酶；(5)定量检测：向步骤(4)的酶标板每孔中加入100μL底物溶液显色(4.5mL底物缓冲液(2.84gNa2HPO4·12H2O、1.92g柠檬酸，水100mL)+0.5mL2mg/mLTMB溶液+0.32mL30％H2O2，混合均匀)，在28℃孵育15min后于652nm处读取OD652nm值，通过外标法计算外泌体中HIF-1α的含量。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)检测限降低。现有技术是使用辣根过氧化物酶(HRP)作为催化酶，在H2O2存在的情况下将TMB从无色氧化为蓝色，从而达到定量之目的。本专利技术采用纳米金代替HRP，不但实现了氧化TMB的目的；而且所构建的壳核结构Au@HIF-1αaptamer@Au材料，具有表面积更大的金壳，获得比HRP更好的催化效果，从而极大地降低了检测限(可达0.19ng/L)，从而可以不对样品进行浓缩，直接测定血清外泌体中HIF-1α含量。(2)检测成本降低。aptamer是由人工合成的核酸序列，放大工艺简单，批量化生产成本远比天然抗体低。本专利技术用HIF-1αaptamer代替现有技术使用的HIF-1α，从而使得检测成本大为降低。(3)检测试剂的稳定性增大。现有技术使用的HRP催化酶和HIF-1α抗体，都属于天然生物大分子，对光、热、化学试剂等均较敏感，极易失活，保存条件苛刻且时间短；本专利技术分别使用纳米酶和HIF-1αaptamer代替HRP和HIF-1α抗体，从而大大提高了检测试剂的稳定性，有利于长期保存使用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本专利技术技术路线示意图；图2为纳米金的动态光散射图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Au@HIF-1αaptamer@Au纳米酶的制备及其在隐匿型冠心病检测中的应用，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)制备纳米金：将所有玻璃容器在王水中浸泡过夜后，再用含5％二氯二甲基硅烷的氯仿溶液浸泡5-30min并于室温晾干，最后用去离子水洗涤三次，烘干备用。取50mL 0.05％～1％的HAuCl

【技术特征摘要】
1.一种Au@HIF-1αaptamer@Au纳米酶的制备及其在隐匿型冠心病检测中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备纳米金：将所有玻璃容器在王水中浸泡过夜后，再用含5％二氯二甲基硅烷的氯仿溶液浸泡5-30min并于室温晾干，最后用去离子水洗涤三次，烘干备用。取50mL0.05％～1％的HAuCl4溶液至锥形瓶中，搅拌加热至沸腾。随后迅速向其中加入5mL0.5％～5％柠檬酸钠溶液，待溶液呈酒红色后保持沸腾10-30min；最后停止加热，在搅拌下冷却至室温，用去离子水定容至50mL即得纳米金溶液，置于4℃备用；
(2)制备Au@HIF-1αaptamer：将0.1mM的HIF-1αaptamer溶液与步骤(1)所得的纳米金溶液按照1:10～1：500的体积比混合，于室温下避光、温和搅拌4～16h；然后在温和搅拌下，向其中滴加50μL0.5MTris-acetate液(pH8.2)和500μL1MNaCl溶液，室温避光静置24h。最后，通过离心(16000g，20min)使产物完全沉积于EP管底部，并用Tris-acetate液洗涤两次后，再分散即得Au@HIF-1αaptamer溶液，置于4℃保存备用；
(3)提取血清中的外泌体：全血不抗凝室温静置放置1h后离心(3000g，10min)，将所得上清液再次离心(3000g，10min)得到血清。将血清用PBS缓冲液1:1稀释后离心(10000g，30min)，将所得上清液用0.2μm微孔滤膜过滤，而后超速离心(100000g，70min)，将所得沉淀用PBS缓冲液洗涤一次后分散于PBS缓冲液中得到外泌体溶液，置4℃保存备用；
(4)制备Au@HIF-1αaptamer@Au纳米酶：向HIF-1α抗体包被酶标板中加入50μL外泌体溶液样品，37℃孵育30min，随后向中加入50μL步骤(2)所得的Au@HIF-1αaptamer溶液，室温下继续孵育30min；在...

【专利技术属性】
技术研发人员：青琳森，罗培，王乾龙，黄维雪，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51