一种肝素中细菌内毒素的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种肝素中细菌内毒素的检测方法，方法包括：Step1：用细菌内毒素检查用水溶解细菌内毒素标准品；Step2：用细菌内毒素检查用水稀释细菌内毒素标准品溶液至0.01‑5EU/mL范围内；Step3：用细菌内毒素检查用水溶解动态浊度法鲎试剂；Step4：将Step2配制的细菌内毒素标准品溶液取于反应容器中，加鲎试剂，置于内毒素检测仪检测；Step5：配制样品溶液；Step6：配制加标样品溶液：将样品溶液和细菌内毒素标准品溶液，混匀即得；Step7：取Step5中配制的样品溶液和Step6中配置的加标样品溶液分别置于两个反应容器中，分别加入Step3中制备的鲎试剂，置于内毒素检测仪检测。

A method for the detection of bacterial endotoxin in heparin

【技术实现步骤摘要】
一种肝素中细菌内毒素的检测方法
本专利技术涉及药物制剂
，具体涉及普通肝素或低分子肝素中的细菌内毒素的检测方法。
技术介绍
肝素首先从肝脏发现而得名，由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂。它也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。作为一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断扩大。肝素钠(Heparinsodium)具有带强负电荷的理化特性，能干扰血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝血作用。其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)结合，而增强后者对活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。其后果涉及阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。细菌内毒素是检测肝素和低分子肝素中的重要指标，目前，用细菌内毒素凝胶法来检测肝素和低分子肝素中的细菌内毒素，但该方法为限度试验，由于鲎试剂灵敏度差，无法满足肝素和低分子肝素中细菌内毒素含量绝对值的定量表征。因此，研发一种新的检测肝素中细菌内毒素的方法很重要。本申请将动态浊度法用于肝素和低分子肝素中细菌内毒素的定量检测，在现有技术中，该方法没法应用于肝素分子中，而本专利技术人通过多年研究，突破了本领域长期构建的不可能实现的技术难点，摸索到了专门针对肝素、低分子肝素的检测，且精确度高。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的缺陷提供了一种肝素中细菌内毒素的检测方法，旨在克服现有技术中的不足。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现：本专利技术的一个专利技术点为提供一种肝素中细菌内毒素的检测方法，所述方法包括如下步骤：Step1：用细菌内毒素检查用水溶解细菌内毒素标准品，置于混悬器上混悬5min；Step2：用细菌内毒素检查用水稀释细菌内毒素标准品溶液至0.01-5EU/mL范围内；如0.01-1EU/mL；Step3：用细菌内毒素检查用水溶解动态浊度法鲎试剂；Step4：将Step2配制的细菌内毒素标准品溶液取于反应容器中，加鲎试剂，置于内毒素检测仪检测；Step5：配制样品溶液：细菌内毒素检查用水配制样品溶液，配制样品溶液的溶液浓度为3～10IU/mL；所述样品包括肝素或低分子肝素；肝素包括肝素钠和肝素钙，低分子肝素包括依诺肝素钠、达肝素钠、那屈肝素钙。Step6：配制加标样品溶液：将样品溶液和细菌内毒素标准品溶液，混匀即得；Step7：取Step5中配制的样品溶液和Step6中配置的加标样品溶液分别置于两个反应容器中，分别加入Step3中制备的鲎试剂，置于内毒素检测仪检测。用Step4绘制的标准曲线标定待测样品中细菌内毒素含量和加标样品中细菌内毒素含量，结果分别为0.0220EU/mL和0.1284EU/mL，此时细菌内毒素的回收率为106％，证明在此试验条件下的测定值有效。进一步地，Step1中的细菌内毒素含量小于0.005EU/mL；细菌内毒素标准品的稀释方法中，每2-10倍稀释为一个检测点。进一步地，Step2中所述菌内毒素标准品的稀释方法中，稀释的检测点的具体浓度梯度及体积为：1EU/mL0.7mL，0.2EU/mL1.8mL，0.1EU/mL1mL，0.02EU/mL1.4mL，0.01EU/mL1.2mL；所述细菌内毒素标准品的稀释方法中，稀释时，混匀时间为30s。进一步地，Step4中，将所配制的至少3个浓度梯度细菌内毒素标准品溶液于反应容器中；每个浓度取0.1mL于反应容器中，各加鲎试剂0.1mL，置于内毒素检测仪检测。进一步地，在内毒素检测仪中的检测方法为：自动混匀5-10s，检测温度37℃±1℃，检测波长405nm。进一步地，在Step4中，选细菌内毒素检查用水为阴性对照，且当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析，根据线性回归分析，获知标准曲线的相关系数(r)的绝对值。进一步地，在Step5中，配制样品溶液的溶液浓度为5-7IU/mL，如6IU/mL。进一步地，在Step6中，配制加标样品溶液：取等体积的12IU/mL样品溶液和0.2EU/mL细菌内毒素标准品溶液。进一步地，在Step7中，取Step5中配制的样品溶液和Step6中配置的加标样品溶液各0.1mL分别置于两个反应容器中，分别加入0.1mStep3中制备的鲎试剂，置于内毒素检测仪检测，自动混匀5-10s，检测温度37℃±1℃，检测波长405nm。进一步地，用Step4绘制的标准曲线标定待测样品中细菌内毒素含量和加标样品中细菌内毒素含量。本专利技术提供了一种肝素中细菌内毒素的检测方法，其主要具有的有益效果为：本专利技术突破性的将动态浊度法用于肝素和低分子肝素等中细菌内毒素的定量检测方法，且该方法不仅能够检测10kDa以上的大分子，还可以检测分子量为几百几千的相对小一些的分子，应用广泛，且精确度极高，可适用于所有类型肝素、低分子肝素的检测，突破了本领域长此以往不能检测肝素、且只能检测大分子的的技术难点。本专利技术通过采用特定的样品溶液浓度、加标样品溶液浓度、内毒素标准品浓度、检测条件以及其他的条件等的共同配合，实现了精确测定、且无干扰。尤其是样品溶液浓度为6IU/mL、检测过程中采用自动混匀5-10S，检测温度37℃±1℃，检测波长405nm，等等，对于精确、无干扰的检测肝素/低分子肝素等中的细菌内毒素极其重要。其中，肝素包括肝素钠和肝素钙，低分子肝素包括依诺肝素钠、达肝素钠、那屈肝素钙。本专利技术通过检测出肝素和低分子肝素中细菌内毒素含量的具体数值，为后续指导车间生产工艺优化和产品质量提升提供支持。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术具体实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种肝素中细菌内毒素的检测方法，所述方法包括如下步骤，且在操作过程中需要对所使用的器具进行无细菌内毒素预处理；Step1：用细菌内毒素检查用水溶解细菌内毒素标准品，置于混悬器上混悬5min；其细菌内毒素含量优选小于0.005EU/mL；用细菌内毒素检查用水稀释细菌内毒素标准品溶液至0.01-5EU/mL范围内，每2-10倍稀释为一个检测点。稀释时，混匀时间为30s。具体浓度梯度及体积为：0.01EU/mL，1.2mL；0.02EU/mL，1.4mL；0.1EU/mL，1mL；0.2EU/mL，1.8mL；1EU/mL，0.7mL；St本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝素中细菌内毒素的检测方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：/nStep1：用细菌内毒素检查用水溶解细菌内毒素标准品，置于混悬器上混悬5min；/nStep2：用细菌内毒素检查用水稀释细菌内毒素标准品溶液至0.01-5EU/mL范围内；/nStep3：用细菌内毒素检查用水溶解动态浊度法鲎试剂；/nStep4：将Step2配制的细菌内毒素标准品溶液取于反应容器中，加鲎试剂，置于内毒素检测仪检测；/nStep5：配制样品溶液：细菌内毒素检查用水配制样品溶液；配制样品溶液的溶液浓度为3～10IU/mL；所述样品包括肝素或低分子肝素；肝素包括肝素钠和肝素钙，低分子肝素包括依诺肝素钠、达肝素钠、那屈肝素钙；/nStep6：配制加标样品溶液：将样品溶液和细菌内毒素标准品溶液，混匀即得；/nStep7：取Step5中配制的样品溶液和Step6中配置的加标样品溶液分别置于两个反应容器中，分别加入Step3中制备的鲎试剂，置于内毒素检测仪检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝素中细菌内毒素的检测方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
Step1：用细菌内毒素检查用水溶解细菌内毒素标准品，置于混悬器上混悬5min；
Step2：用细菌内毒素检查用水稀释细菌内毒素标准品溶液至0.01-5EU/mL范围内；
Step3：用细菌内毒素检查用水溶解动态浊度法鲎试剂；
Step4：将Step2配制的细菌内毒素标准品溶液取于反应容器中，加鲎试剂，置于内毒素检测仪检测；
Step5：配制样品溶液：细菌内毒素检查用水配制样品溶液；配制样品溶液的溶液浓度为3～10IU/mL；所述样品包括肝素或低分子肝素；肝素包括肝素钠和肝素钙，低分子肝素包括依诺肝素钠、达肝素钠、那屈肝素钙；
Step6：配制加标样品溶液：将样品溶液和细菌内毒素标准品溶液，混匀即得；
Step7：取Step5中配制的样品溶液和Step6中配置的加标样品溶液分别置于两个反应容器中，分别加入Step3中制备的鲎试剂，置于内毒素检测仪检测。


2.根据权利要求1所述的肝素中细菌内毒素的检测方法，其特征在于：Step1中的细菌内毒素含量小于0.005EU/mL；细菌内毒素标准品的稀释方法中，每2-10倍稀释为一个检测点。


3.根据权利要求2所述的肝素中细菌内毒素的检测方法，其特征在于：Step2中所述细菌内毒素标准品的稀释方法中，稀释的检测点的具体浓度梯度及体积为：1EU/mL0.7mL，0.2EU/mL1.8mL，0.1EU/mL1mL，0.02EU/mL1.4mL，0.01EU/mL1.2mL；
所述细菌内毒素标准品的稀释方法中，稀释时，混匀时间为30s。


4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：恽卫东，陶翎，张贵莲，
申请(专利权)人：常州千红生化制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32