一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于生物正交反应改变纳米磁颗粒数量及状态，进而检测农药残留的生物传感方法，该方法基于二苯基环辛炔与叠氮的级联生物正交反应同时改变纳米磁颗粒的数量和聚集状态，实现了磁纳米颗粒数量和状态的可控调节，二者有机结合进行磁信号级联放大，从而提高农药残留检测的准确性和灵敏度。

A method of detecting pesticide residues by magnetic relaxation time sensor based on the change of the number and state of nanoparticles

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法
本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法。
技术介绍
食品安全关系广大人民群众身体健康，是一项重要的民生工程，而食品中农药残留是危害人类健康的一个重要的食品安全问题。由于违规使用高毒农药、病虫抗药性增强、农药使用不当等原因常常造成农药残留超标，而农药残留对人体健康危害巨大，会造成急性中毒或慢性中毒，降低人体免疫力、可致癌、致畸和致突变，甚至造成个体死亡。鉴于农药残留给健康带来的巨大危害，减少、合理使用农药是解决问题的根本措施，而食品中农药残留的快速、准确检测则是保证合理使用的前提和保障人民群众舌尖上安全的最后一道防线。目前，对食品中农药残留定性定量分析的主要手段是仪器分析法、酶抑制法和免疫分析法。仪器分析方法具有灵敏度高、准确性好等优势，但样品前处理复杂，检测成本高，需要较高水平的专业技术人员，不适合现场快速检测。酶抑制法主要针对有机磷农药，具有操作简单、成本低等优势，但其容易受样品基质的干扰，假阳性比较多，准确性不够。传统免疫分析主要包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)和胶体金免疫层析试纸条方法。ELISA具有操作相对简单、高通量等优势，但是，某些农药残留的浓度可能非常低，传统的ELISA方法无法满足检测需求。胶体金免疫层析试纸条方法具有操作简单、检测速度快等优势，但其灵敏度低，容易受到基质干扰等。因此传统的免疫测定法无法满足检测灵敏度的实际需求。筛选具有较高亲和力结合的抗体可以提高的灵敏度，但往往较为昂贵。因此，非常有必要在不损害方法特异性的前提下，提高免疫分析方法的灵敏度。各种纳米材料由于其独特的物理化学特性，已被用于改善传统免疫分析方法的分析性能。纳米粒子具有较大比表面积，多样的表面化学，被广泛地应用于免疫分析中的富集和分离，以简化预处理。纳米颗粒的光学、电化学和磁特征也极大的增强了传统免疫分析中的信号读出与放大。在各种纳米颗粒中，磁性纳米颗粒(MNPs)引起了人们极大的兴趣，因为MNPs不仅可以在磁场下很容易地分离，用在样品预处理的载体，而且还可以用作磁信号传感探针，因为MNPs可以导致一个不均匀的磁场，而不均匀的磁场会显著缩短周围水分子质子的横向弛豫时间(T2)。此外，由于样品基质中的磁信号可忽略不计，因此基于MNPs的磁弛豫时间免疫传感器具有很高的信噪比，在食品安全和临床诊断等领域得到了广泛地应用。传统的磁免疫传感器的传感机理主要分为两个方面：(1)MNPs的状态变化：MNPs偶联上抗体之后，由于抗体-抗原之间的免疫识别作用，可以使原来分散的MNPs变成聚集状态，进而会引起一个不均匀的磁场，导致T2信号发生改变，而传统磁免疫传感器的信号大都取决于MNPs的状态变化，其灵敏度不足以检测痕量的靶标，并且很容易受到非特异性聚集的干扰。(2)MNPs数量的变化：有研究表明磁信号T2对纳米磁颗粒MNPs数量的变化更为敏感，因此，有研究者通过结合免疫磁分离，可以实现目标物和磁颗粒数量变化的一一对应，进而构建了基于纳米磁颗粒数量变化的磁弛豫时间免疫传感器，用于生物大分子，例如食源性致病菌、病毒等检测。然而像农药这类小分子化学物仅具有一个抗体结合位点，不能有效导致磁颗粒数量的改变，因此，需要借助其他放大手段才能将磁弛豫时间免疫传感器用于痕量的农药残留小分子的高灵敏检测。生物正交反应(Bioorthogonalreactions，BRs)具有反应速度快，特异性好等优势，通过层层组装的生物正交反应，可以极大增强MNPs结合在目标物上面的量，进而放大T2信号并增强传统磁横向弛豫时间免疫传感器(T2-MRS)的灵敏度。因此，层层组装的生物正交反应为克服T2-MRS检测痕量小分子目标的灵敏度提供了一种有吸引力的工具。更为重要的是，一方面，我们通过生物正交反应，可以增加纳米磁颗粒的偶联量，进而引起纳米磁颗粒数量的改变；同时，我们发现，通过生物正交反应，也可以使原来处于分散状态的纳米磁颗粒变成聚集状态，即引起纳米磁颗粒状态的改变，从而进一步放大T2信号。因此，基于级联生物正交反应，在MNPs数量的变化的基础上，有机结合了MNPs的状态变化，实现磁信号的级联放大，进而构建了超灵敏的磁弛豫时间免疫传感器，用于农药小分子的快速检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于生物正交反应检测农药残留的生物传感器方法，该方法可同时改变纳米磁颗粒的聚集状态和数量，二者有机结合进行磁信号级联放大，从而提高农药残留检测的准确性和灵敏度。一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法，包括以下步骤：1)将待测农药与载体蛋白偶联，然后再与羧基磁珠反应，得到偶联有待测农药完全抗原的磁珠；2)将识别待测农药的单克隆抗体与二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活性酯(DBCO-PEG4-NHSester)反应，得到二苯基环辛炔(DBCO)修饰的单克隆抗体；3)将偶联有待测农药完全抗原的磁珠和DBCO修饰的单克隆抗体加入到待测样品溶液中，发生免疫竞争反应，磁分离后得到“磁珠-完全抗原-抗体-DBCO”免疫复合物；4)将15-叠氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亚胺基酯(Azide-PEG4-NHSester)与氨基纳米磁颗粒反应，得到叠氮(Azide)标记的纳米磁颗粒(azide-MNPs)，将产物磁分离后用PBS缓冲液重悬，然后加入到步骤3)得到的免疫复合物中，使Azide与DBCO发生生物正交反应，从而将纳米磁颗粒偶联到磁珠上，磁分离后收集上清液，上清液中含有未反应的azide-MNPs并且没有反应的azide-MNPs数量和待测物的含量成正相关；5)向步骤4)磁分离后的上清液中加入叠氮化物交联剂，触发生物正交反应，形成纳米磁颗粒-叠氮-叠氮化物交联剂-叠氮-纳米磁颗粒复合物，从而将原来分散状态的纳米磁颗粒改变为聚集状态，使磁免疫传感器的横向弛豫时间信号被级联放大，测量其横向弛豫时间进而对农药残留定量分析。优选地，所述羧基磁珠的粒径为500-3000nm。优选地，所述氨基纳米磁颗粒的粒径为10-100nm。优选地，所述叠氮化物交联剂为二苯基环辛炔-四聚乙二醇-二苯基环辛炔(DBCO-PEG4-DBCO)。优选地，所述15-叠氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亚胺基酯与氨基纳米磁颗粒的重量比为1：5。优选地，所述单克隆抗体与二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活性酯反应的摩尔比为1：10。优选地，标记叠氮(Azide)的纳米磁颗粒与DBCO-PEG4-DBCO生物正交反应的反应时间为20min。优选地，所述农药为小分子化合物农药，例如毒死蜱。优选地，所述农药的载体蛋白为牛血清白蛋白。在本专利技术中，我们基于级联生物正交反应(BRs)实现了磁纳米颗粒(MNPs)数量和状态的可控调节，并在此基础上构建了一种超灵敏的磁弛豫时间免疫传感器，用于农药残留的检测。利用快本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器对农药残留进行检测的方法，其特征在于包括以下步骤：/n1)将待测农药与载体蛋白偶联，然后再与羧基磁珠反应，得到偶联有待测农药完全抗原的磁珠；/n2)将识别待测农药的单克隆抗体与二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活泼酯反应，得到二苯基环辛炔修饰的单克隆抗体；/n3)将偶联待测农药完全抗原的磁珠和二苯基环辛炔修饰的单克隆抗体加入到待测样品溶液中，发生免疫竞争反应，磁分离后得到的“磁珠-完全抗原-抗体-二苯基环辛炔”的免疫复合物；/n4)将15-叠氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亚胺基酯与氨基纳米磁颗粒反应，得到叠氮标记的纳米磁颗粒，将产物磁分离后用PBS缓冲液重悬，然后加入到步骤3)得到的“磁珠-完全抗原-抗体-二苯基环辛炔”免疫复合物中，叠氮与二苯基环辛炔发生生物正交反应，从而叠氮标记的纳米磁颗粒偶联到磁珠上，磁分离后收集上清液，上清液中叠氮标记的纳米磁颗粒数量发生改变；/n5)向步骤4)磁分离后的上清液中加入叠氮化物交联剂，触发生物正交反应，将原来分散状态的叠氮-纳米磁颗粒变为聚集状态，使磁免疫传感器的横向弛豫时间信号被级联放大，测量其横向弛豫时间进而对农药残留定量分析。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器对农药残留进行检测的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将待测农药与载体蛋白偶联，然后再与羧基磁珠反应，得到偶联有待测农药完全抗原的磁珠；
2)将识别待测农药的单克隆抗体与二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活泼酯反应，得到二苯基环辛炔修饰的单克隆抗体；
3)将偶联待测农药完全抗原的磁珠和二苯基环辛炔修饰的单克隆抗体加入到待测样品溶液中，发生免疫竞争反应，磁分离后得到的“磁珠-完全抗原-抗体-二苯基环辛炔”的免疫复合物；
4)将15-叠氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亚胺基酯与氨基纳米磁颗粒反应，得到叠氮标记的纳米磁颗粒，将产物磁分离后用PBS缓冲液重悬，然后加入到步骤3)得到的“磁珠-完全抗原-抗体-二苯基环辛炔”免疫复合物中，叠氮与二苯基环辛炔发生生物正交反应，从而叠氮标记的纳米磁颗粒偶联到磁珠上，磁分离后收集上清液，上清液中叠氮标记的纳米磁颗粒数量发生改变；
5)向步骤4)磁分离后的上清液中加入叠氮化物交联剂，触发生物正交反应，将原来分散状态的叠氮-纳米磁颗粒变为聚集状态，使磁免疫传感器的横向弛豫时间信号被级联放大，测量其横向弛豫时间进而对农药残留...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翊平，董永贞，曾令文，
申请(专利权)人：武汉市农业科学院，华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42