同步检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素胶体金免疫层析试纸条制造技术

本发明专利技术涉及同步检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T‑2毒素胶体金免疫层析试纸条。它包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上横向设置有质控线和检测线，检测线位于质控线的下方，个数为三条，呈间隔分布，三条检测线上分别包被有各毒素蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；金标垫横向喷涂有胶体金标记的各抗体；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生。能在一条试纸条上实现对二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T‑2毒素三种真菌毒素的同步、快速检测。

Simultaneous detection of fusaril diacetate, deoxynivalenol and T-2 toxin colloidal gold immunochromatographic strip

【技术实现步骤摘要】
同步检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素胶体金免疫层析试纸条
本专利技术提供了一种同步检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇(蛇形毒素)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素)、T-2毒素的胶体金免疫层析试纸条及制备方法。
技术介绍
真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，粮食和饲料在种收储运过程中均可产生真菌毒素的污染。二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素是粮食饲料中常见的真菌毒素。乙酸镳草镰刀菌烯醇，也被称为蛇形毒素，属于单端孢多霉烯毒素，主要由镳草镰刀菌和木贼镰刀菌产生，脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素是由某些镰刀菌产生的一种单端孢霉烯族毒素，三种真菌毒素在粮食包括小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等及花生、豆类等粮食和饲料中广泛发生。该三种毒素对人和动物均有极大危害，人畜摄入了被二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。鉴于真菌毒素的危害作用及其在粮食和饲料中的广泛发生，世界各国对其含量进行了严格限定。因此为了加强对粮食和饲料中这些真菌毒素的检测，尤其是快速检测，是了解和掌握食品及饲料安全卫生信息，增强食品安全消费的重要环节。现有对真菌毒素的检测方法主要包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。薄层层析法检测真菌毒素时，不需要特殊的仪器设备，在一般实验室都可进行，但检测试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括高效液相色谱法、液相色谱与质谱及串联质谱联用的方法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求所检测的样品的纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境和检测人员要求高，难以实现快速检测，检测成本高。免疫分析方法克服了薄层层析法和仪器分析法的缺点，由于其特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点在近年来获得了快速发展。基于胶体金标记抗体与抗原特异性结合反应的免疫层析试纸条的检测结果肉眼可见，不需要大型仪器设备，检测成本低，分析时间短，从而可实现对各种真菌毒素等微量残留物的定性、在线、快速检测。而我国小农户分散型的种植方式，农产品中真菌毒素发生率高，且同一农产品受多种真菌毒素污染的可能性大，因此迫切需要能快速、同步检测多种真菌毒素的检测技术，以实现对粮食及饲料中多种真菌毒素的同步、快速、准确监测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供一种同步检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素混合污染的胶体金免疫层析试纸条及制备方法。其可用于样品中二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素三种真菌毒素含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为：同步检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素的胶体金免疫层析试纸条，包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上横向设置有质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为三条，呈间隔分布，所述三条检测线上分别包被有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DON-BSA)和T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物(T-2-BSA)，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有胶体金标记的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体、胶体金标记的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体和胶体金标记的抗T-2毒素单克隆抗体；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生。按上述方案，所述的吸水垫长16～18mm，宽3～4mm，检测垫长18～30mm，宽3～4mm；金标垫长10～12mm，宽3～4mm；样品垫长12～15mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。按上述方案，所述检测垫上每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，所述靠近质控线的检测线与质控线的间距为5～7mm。按上述方案，所述检测垫包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)的检测线上每厘米所需要的二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)的包被量为100～300ng；包被脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DON-BSA)的包被量为100～300ng；包被T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物(T-2-BSA)的检测线上每厘米所需要的T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物(T-2-BSA)的包被量为100～300ng；质控线上每厘米所需要的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50～200ng。按上述方案，所述金标垫中所用的胶体金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的胶体金标记的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的胶体金标记的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇克隆抗体的用量为100～200ng，所需胶体金标记的抗T-2毒素单克隆抗体的用量为200～400ng。按上述方案，优选地，抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的IC50小于等于15ppb。按上述方案，抗T-2毒素单克隆抗体的IC50小于等于2ppb。如上所述同步检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁即得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被：将二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DON-BSA)和T-2毒素-牛血清白蛋白的偶联物(T-2-BSA)用包被缓冲液分别配制成0.25～0.5mg/mL的包被液，用点喷方式将其于硝酸纤维素膜上进行分别包被，得到三条检测线，然后于37～40℃条件下干燥30～60分钟；所述包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)的检测线上每厘米所需要的二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)的包被量为100～300ng；包被脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DON-BSA)的包被量为100～300ng；包被T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物的检测线上所需要的T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物(T-2-BSA)的包被量为100～300ng，所述每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm；质控线的包被：将兔抗鼠多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.同步检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上横向设置有质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为三条，呈间隔分布，所述三条检测线上分别包被有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DON-BSA)和T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物(T-2-BSA)，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有胶体金标记的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体、胶体金标记的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体和胶体金标记的抗T-2毒素单克隆抗体；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生。/n

【技术特征摘要】
1.同步检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上横向设置有质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为三条，呈间隔分布，所述三条检测线上分别包被有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DON-BSA)和T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物(T-2-BSA)，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有胶体金标记的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体、胶体金标记的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体和胶体金标记的抗T-2毒素单克隆抗体；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生。


2.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫长16～18mm，宽3～4mm，检测垫长18～30mm，宽3～4mm；金标垫长10～12mm，宽3～4mm；样品垫长12～15mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。


3.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫为吸水纸。


4.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫上每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，所述靠近质控线的检测线与质控线的间距为5～7mm。


5.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)的检测线上每厘米所需要的二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)的包被量为100～300ng；包被脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DON-BSA)的包被量为100～300ng；包被T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物(T-2-BSA)的检测线上每厘米所需要的T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物(T-2-BSA)的包被量为100～300ng；质控线上每厘米所需要的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50～200ng。


6.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述金标垫中所用的胶体金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的胶体金标记的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的胶体金标记的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇克隆抗体的用量为100～200ng，所需胶体金标记的抗T-2毒素单克隆抗体的用量为200～400ng。


7.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的IC50小于等于15ppb；抗T-2毒素单克隆抗体的IC50小于等于2ppb。


8.权利要求1所述的同步检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：
将二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DON-BSA)和T-2毒素-牛血清白蛋白的偶联物(T-2-BSA)用包被缓冲液分别配制成0.25～0.5mg/mL的包被液，用点喷方式将其于硝酸纤维素膜上进行分别包被，得到三条检测线，然后于37～40℃条件下干燥30～60分钟；所述包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)的检测线上每厘米所需要的二乙酸镳草镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DAS-BSA)的包被量为100～300ng；包被脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的脱氧雪腐镰刀菌烯醇-牛血清白蛋白偶联物(DON-BSA)的包被量为100～300ng；包被T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物的检测线上所需要的T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物(T-2-BSA)的包被量为100～300ng，所述每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm；
质控线的包被：
将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液液配制成0.2～0.4mg/mL的包被液，于距靠近质控线的检测线5～7mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50～200ng，然后于37～40℃条件下干燥1～2小时；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)金标垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～10小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂胶体金标记的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体溶液、胶体金标记的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体溶液和胶体金标记的抗T-2毒素单克隆抗体溶液的混合溶液，其中：每厘米喷涂长度所需的胶体金标记的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的胶体金标记的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的抗T-2毒素单克隆抗体的用量为200～400ng，然后真空冷冻干燥2～4小时，置干燥器中室温保存；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生；
(5)试纸条的组装
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张兆威，唐晓倩，王督，张奇，李培武，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42