间接聚合和标记的抗体及其制备方法技术

＊＊＊ （２） 高灵敏度间接聚合和标记的抗体，该抗体促进样本溶液中低浓度抗原的检测。其制备方法为用多功能试剂聚合抗体，将聚合抗体经抗体的二硫键与蛋白质结合形成聚合抗体结合物，用上式所示花青染料标记结合物：其中，Ｒ↓［１］和Ｒ↓［２］为氢或烷基，Ｘ为卤素，Ｍ为氢或碱金属，ｎ为整数１－４。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过抗体聚合，所得聚合抗体结合于蛋白质形成蛋白复合物或聚合的抗体结合物并用花青染料标记该结合物而制成的间接聚合和标记的抗体，还涉及其制备方法。用染料标记制成的染料标记抗体是肉眼可见的，与样本溶液中所含的免疫原或抗原有特异性反应。因此，这样的抗体用于例如在免疫传感器中借助抗原-抗体免疫反应检出样本溶液中所含的特异性物质即抗原，在各种医疗机构中作为诊断工具具有广阔的应用。花青染料是标记抗体最常用的染料，因为它们反应性强、摩尔吸光系数高(见Bioconjugate Chemistry Vol.4,No.2,pp.105-111,1993)。这些花青染料具有与抗体上存在的氨基或羧基反应形成共价键的官能团。花青染料与抗体的结合比为每分子抗体20-50个花青染料分子。这样制成的花青染料标记抗体被应用于如免疫色谱法，因为其可见度通常高，并广泛地用于检测小量特异性物质，如只在妊娠妇女尿中含有的绒毛膜促性腺素。正常抗体包括数百至数千个氨基或羧基。但是，通常的解释是，由于其三维结构，在这么多的氨基或羧基中，只有50个左右可参与反应，这使每分子抗体上花青染料的结合分子数限制为50个分子。而且，由于抗体与抗原的反应部位仅限于每分子2个，因此抗体与抗原结合敏感性低。在免疫传感器等中使用这样的标记抗体限制了传感器的敏感性，当样本溶液中被分析物即抗原浓度低时产生难于检测的重大问题。鉴于上述问题，本专利技术的目的在于提供高度敏感的间接聚合和标记抗体，促进样本溶液中低浓度被分析物的检出。本专利技术的另一个目的在于提供上述间接聚合和标记抗体的制备方法。本专利技术提供间接聚合和标记的抗体，包含抗体和用于标记抗体的染料，该染料为以如下化学式(1)-(4)之一表示的花青染料 其中，R1和R2表示氢或烷基，X表示卤素，M表示氢或碱金属，n表示整数1-4，其中，抗体经多功能试剂聚合并经二硫键结合于蛋白质形成聚合的抗体结合物，该抗体结合物被花青染料标记。通过将抗体聚合制得的聚合抗体是多价的，具有很多与抗原反应部位，因此与其它常见的二价抗体相比，其结合敏感性高。此外，当结合到蛋白质上后，所得的聚合抗体结合物与花青染料结合的面积增加，还增加了染料与聚合抗体结合物的结合分子数目。结果，用上述方法得到的间接聚合和标记抗体可具有极好的可见度。本专利技术间接聚合和标记的抗体用于例如免疫色谱法，促进以高敏感性检出低浓度被分析物即抗原。按照本专利技术的间接聚合和标记抗体因其高敏感性，还可用于任何类型的生物传感器。在本专利技术的一个较佳实施模式中，间接聚合和标记抗体具有的结构是其花青染料骨架经花青染料中存在的琥珀酰亚胺的酰基碳与聚合抗体结合物中存在的氨基氮之间的共价键结合于聚合抗体结合物。按照本专利技术的间接聚合和标记抗体，其合乎需要的抗体聚合度可以在2-50范围内。按照本专利技术的间接聚合和标记抗体的制备方法包括以下步骤在中性或弱碱性磷酸盐缓冲液中，用多功能试剂将抗体聚合，形成聚合抗体；在中性或弱碱性磷酸盐缓冲液中，将蛋白质还原形成还原蛋白，使聚合抗体与还原蛋白反应，形成聚合抗体结合物，将该聚合抗体结合物与染料反应，从而用染料标记聚合抗体结合物，染料为化学式(1)-(4)之一表示的花青染料。在本专利技术的另一个实施模式中，该方法可包括如下步骤在中性或弱碱性磷酸盐缓冲液中，用多功能试剂将抗体聚合，形成聚合抗体；在中性或弱碱性磷酸盐缓冲液中，将蛋白质还原形成还原蛋白，使还原蛋白与染料反应，形成标记蛋白，将聚合抗体与标记蛋白反应，染料为化学式(1)-(4)之一表示的花青染料。在任何一个方法中，磷酸盐缓冲液的较佳pH值在7.0-8.0范围内。可用于本专利技术的较佳聚合和标记抗体的抗体不限于特定的抗体，任何抗体无论其来源和亚型均可使用。可用的抗体的例子为各种免疫球蛋白(Ig)，如小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠IgA、小鼠IgE、大鼠IgG、大鼠IgM、大鼠IgA、大鼠IgE、家兔IgG、家兔IgM、家兔IgA、家兔IgE、山羊IgG、山羊IgM、山羊IgE、山羊IgA、绵羊IgG、绵羊IgM、绵羊IgA、绵羊IgE等。这些抗体可从商业途径购得或可从受关注的动物身上得到。多功能试剂可列举在同一个分子上有两个或两个以上能结合于抗体的官能团如琥珀酰亚胺基、吡啶基二硫基等的试剂。这些试剂的例子可以是化学式(5)所示丙酸二硫基磺基琥珀酰亚胺酯、化学式(6)所示辛二酸二(磺基琥珀酰亚胺)酯、化学式(7)所示酒石酸二琥珀酰亚胺酯、化学式(8)所示二(琥珀酰亚胺基琥珀酸乙二醇酯、化学式(9)所示N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸等。结合于聚合抗体上的蛋白质可以是不起抗体作用的任何蛋白质。较好的是高水溶性蛋白。例如，血清白蛋白较佳，因为它对抗原-抗体反应无抑制作用，并极易溶于水。化学式(1)或(2)所示花青染料是有利于宏观确认的红色染料。化学式(1)所示染料共价碳原子数目少，具有高度水溶性，而化学式(2)所示染料具有很深的红色，最易于宏观确认。如果用仪器如传感器确认花青染料的呈色反应，染料的颜色不限于红色，化学式(3)或(4)所示蓝色染料同样也可使用。化学式(3)或(4)所示染料不太可能受样本溶液中杂质的不良影响，因为它们的吸收谱仅存在于长波长区域。在化学式(1)-(4)中，X表示的卤素可列举氟、氯、溴或碘，M表示的金属可列举锂、钠、钾等。本专利技术的新特征在所附的权利要求中特别加以阐述，本专利技术无论其组成和内容，以及其它目的和特征，均可结合附图从下面的详细描述中得到更好的理解和认识。附图说明图1是阐明本专利技术的一个实施例中所用的免疫色谱法的斜视图。首先，描述式(2)所示花青染料的合成途径的一个实施例。 第一步，将肼基苯磺酸(10)和异丙基甲基酮溶于酸溶剂，加热生成磺酸假吲哚鎓(11)。在磺酸假吲哚鎓(11)的醇溶液中加入金属氢氧化物的饱和醇溶液，生成磺酸假吲哚鎓的金属盐(12)。第二步，将卤代烷酸加到金属盐(12)的有机溶液中，加热生成磺酸羧基烷基假吲哚鎓的另一个金属盐(13)。此处，考虑到卤代烷酸的水溶性问题，以具有1-4个碳原子为佳。最后一步，将金属盐(13)和原甲酸乙酯溶于碱性有机溶剂，加热生成羧酸衍生物(14)。然后，将羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳化二亚胺，后者作为缩合剂，加到羧酸衍生物(14)的有机溶剂中，将混合物搅拌，最终生成化学式(2)所示花青染料，用作标记染料。在化学式(1)所示花青染料的合成中，用N-羧基乙基-3,3-二甲基假吲哚代替上述原甲酸乙酯。同样地，在化学式(3)或(4)所示花青染料的合成中，分别用四甲氧基丙烷或戊烯二醛四甲基缩醛代替上述原甲酸乙酯。化学式(1)-(4),(13)和(14)所示化合物中所含的卤素可列举氟、氯、溴或碘。化学式(1)-(4)和(12)-(14)所示化合物中所含的金属可列举锂、钠、钾等。下面将描述用多功能试剂进行抗体聚合反应的机制。 起始反应如式(15)所示，当多功能试剂，具有两个或两个以上琥珀酰亚胺基的二硫二(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)，加到抗体中时，如式(16)所示，抗体的一个氨基接近多功能试剂的琥珀酰亚胺基的一个酯键。接着，如式(17)所示，氨基和酯基之间发生反应，氨基失去一个氢原子。然后，从氨基释放的游离氢原子结合到琥珀酰亚胺基的琥珀酰亚本文档来自技高网...

【技术保护点】
间接聚合和标记的抗体，包含抗体和用于标记所述抗体的染料，所述染料为以如下化学式（１）－（４）之一表示的花青染料＊＊＊其中，Ｒ↓［１］和Ｒ↓［２］表示氢或烷基，Ｘ表示卤素，Ｍ表示氢或碱金属，ｎ表示整数１－４，其中，所述抗体经多功能 试剂聚合并经二硫键结合于蛋白质形成聚合的抗体结合物，所述聚合的抗体结合物被花青染料标记。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：重藤修行，宫崎仁诚，
申请(专利权)人：松下电器产业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]