DNA的合成方法技术

一种ＤＮＡ合成方法，它能缩短用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）合成ＤＮＡ时所需的时间，其特征在于，在下面（Ａ）和（Ｂ）中所示条件下进行ＰＣＲ时它使用有效量的ＤＮＡ聚合酶，该酶能使每５０μｌ反应液产生超过１０ｎｇ的约２ｋｂ的ＤＮＡ扩增片段：（Ａ）反应液：含ＤＮＡ聚合酶、１ｎｇ大肠杆菌基因组ＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌ的引物Ｅｃｏ－１和Ｅｃｏ－２（引物Ｅｃｏ－１和Ｅｃｏ－２的碱基序列分别列于序列表的序列号１０和１１），且组分适于该酶的体积５０μｌ的反应液，以及（Ｂ）反应条件：以９９℃、１秒～６６℃７秒为１个循环的３５个循环的ＰＣＲ；用于该ＤＮＡ合成方法的ＤＮＡ合成用试剂盒；及ＰＣＲ试剂的产品。上述方法能在与ＰＣＲ相关的基因工程学研究、产业中加快操作速度。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程学领域中应用的缩短聚合酶链式反应(PCR)所需时间的DNA合成方法，该方法中所使用的试剂盒及其制品最近，随着PCR法的开发，耐热性DNA聚合酶成为关注的焦点，开发出适于PCR法的各种DNA聚合酶，并商品化。再者，已知有联合应用多种DNA聚合酶来达到单个DNA聚合酶不能达到的DNA合成方法〔美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)第91卷，第5695～5699页(1994)〕。已知该方法叫做LA-PCR法，就是将具有3′-5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶(例如，来源于激烈热球菌的α型DNA聚合酶)和它具有该活性的DNA聚合酶〔例如，来源于耐热性古细菌水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)〕混合用于PCR的方法。通过该方法，与以往只使用1种DNA聚合酶的PCR相比，扩增出的DNA的收量增加。另外，还能扩增出以往的PCR扩增不出的长链DNA。以往，常规进行的PCR的最适条件显示于表A中。扩增1kbp需大约90分钟的反应时间，扩增10kbp大约需要268分钟的反应时间，扩增20kbp大约需478分钟的反应时间。表A酶Takara Ex Taq*1〔1.25U/50μl(PCR反应液)〕模板DNA大肠杆菌基因组DNA*2〔100ng/50μl(PCR反应液)〕1kbp扩增94℃30秒55℃30秒30循环(约90分)72℃1分10kbp扩增 98℃10秒30循环(约268分)68℃8分20kbp扩增 98℃10秒30循环(约478分)68℃15分*1宝酒造社制品*2宝酒造社制、LA PCRTM用genome DNA set由于PCR法能在短时间内将微量DNA扩增数百倍，所以可应用于包括医学、农学的研究、检查、临床等领域，尤其是在癌和艾滋病类感染性疾病的基因诊断等中发挥威力。另外，应用范围也可扩大到市民生活中，如通过基因诊断确认犯罪者和亲子关系，食品中有害菌中的基因检测等。但是，在某些必须迅速报告检测结果，有必要进行大量PCR的临床检查中，再缩短PCR的反应时间，使PCR高速化成为主要课题。再者，在DNA芯片制作，基因组分析中，PCR操作是必不可缺少的，提高其速率对提高整个研究的效率也是很重要的。本专利技术的第1专利技术是DNA合成方法，它能缩短用聚合酶链式反应(PCR)合成DNA所需要的时间，其特征在于，按下面(A)和(B)中的条件进行PCR时，每50μl反应液中加入有效量的能产生超过10ng的约2kbp DNA扩增片段的DNA聚合酶(A)反应液含DNA聚合酶、1ng大肠杆菌基因组DNA、各10pmol的引物Eco-1和Eco-2(引物Eco-1和Eco-2的碱基序列分别显示于序列表的序列号10和11中)，且适于该DNA聚合酶的组成体积50μl的反应液，以及(B)反应条件99℃、1秒～66℃、7秒为1个循环，进行35个循环。本专利技术的第2专利技术涉及在本专利技术的第1专利技术的DNA合成方法中应用的试剂盒，其特征在于，按下文(A)和(B)中条件进行PCR时，按该试剂盒的说明书配备的PCR试剂包含，每50μl反应液中能产生超过10ng的大约2kb的DNA扩增片段的有效量的DNA聚合酶。(A)反应液包含DNA聚合酶，1ng大肠杆菌基因组DNA，各10pmol的引物Eco-1和Eco-2(引物Eco-1和Eco-2的碱基序列分别显示于序列表的序列号10和11中)，且适于该DNA聚合酶的组成体积为50μl的反应液，及(B)反应条件99℃、1秒～66℃、7秒为1个循环，进行35个循环的PCR。本专利技术的第3专利技术涉及包装材料及封入该包装材料内的PCR试剂组成的制品，该PCR试剂含有DNA聚合酶，该包装材料中附随的记录单或包装材料附随的说明书中表明上述PCR试剂可用于快速PCR；PCR用试剂的制品。本专利技术DNA合成方法由于使用了“有效量的DNA聚合酶”，大大缩短了一定长度的DNA片段互补链合成反应(延长步骤)的时间，即缩短了1个循环的反应所需的时间。结果，通过PCR可在以前没有过的短时间内扩增目的DNA片段，即发挥缩短PCR总时间的高速PCR的优良效果。本专利技术中“有效量的DNA聚合酶”是指，用含有1ng大肠杆菌基因组DNA，各10pmol的引物Eco-1和Eco-2(引物Eco-1和Eco-2的碱基序列分别显示于序列表的序列号10及11中)体积50μl的反应液，99℃、1秒～66℃、7秒为1个循环进行35的循环的PCR时，DNA聚合酶的量是其活性能达到每50μl反应液产生2kb DNA片段的量超过10ng。因此，在该条件下只要有进行PCR的DNA聚合酶的量，其蛋白质量没有限定。通过使用有效量的DNA聚合酶，可使PCR高速化。本说明书中记载的“大肠杆菌基因组织DNA”包括，例如按口野嘉幸、平井久丸、樱木郁之助共著，1987年，Soft Science社发行，《基因和蛋白质的实验操作和杂交》中记载的方法，从大肠杆菌JM109(E.Coli JM 109)中制备出的基因组DNA。另外，该制备方法详细记载于生物观(Bio View)，第13号，第6～5页(1994年，宝洒造社发行)。当该基因组DNA作为LA PCRTM用基因组DNA套时可从宝洒造社购入。反应液组成，只要使用适于所应用的DNA聚合酶的组份的反应液即可。“适于DNA聚合酶的组成”是指它能满足该DNA聚合酶最适种类的缓冲液、最佳pH、最适盐浓度(镁盐等)、最适dNTP浓度、最适引物量、其它添加物等的最适条件。这里DNA聚合酶的酶活性单位以催化模板DNA摄取核苷酸(例如标记的dNTP)的能力为指标。其活性测定方法记载于1966年，D.R.Harper & Row社发行，Cantoni G.L.等编辑的核酸研究方法(Procedures in Nucleic Acids Research)第264页，来自大肠杆菌的DNA聚合酶(DNA Polymerase from E.coli、Richardson C.C.著)中。例如，测定来源于耐热古细菌(水片栖热菌)的Taq DNA聚合酶的活性时所选用的条件如下所示。(a)模板DNA活化的鲑精DNA；(b)反应液组成25mM TAPS(25℃中pH9.3),50mM氯化钾，2mM氯化镁，1mM β-巯基乙醇，各200μM的dATP、dTTP以及100μM的〔α-32P〕dCTP，总量50μl；(c)活性测定方法向含有(a)中的模板DNA的(b)组成的反应液中加入含有Taq DNA聚合酶的试剂，74℃孵育10分钟后，回收反应液中的酸性不溶性物质，测定该物中所含有的放射活性。前面活性测定方法中所应用的活化鲑精DNA如下制备。□将鲑精DNA(Sigma公司)用灭菌水泡胀。□将70U/μl的D NaseⅠ(宝洒造)用150mM氯化钠稀释500倍～4000倍，优选在1500倍～3000倍的范围内稀释。□向20mg上述泡胀的DNA中加入50μl50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、5mM氯化镁、0.05％BSA、上述稀释了的DNaseⅠ，使反应液的体积达10ml。□37℃处理10分钟后，77℃处理10分钟使酶失活。向其中的一部本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＤＮＡ合成方法，它能缩短用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）合成ＤＮＡ时所需的时间，其特征在于，在下面（Ａ）和（Ｂ）中所示条件下进行ＰＣＲ时，使用了有效量的ＤＮＡ聚合酶，它能每５０μｌ反应液扩增出超过１０ｎｇ的约２ｋｂ的ＤＮＡ片段： （Ａ）反应液：体积５０μｌ，含有ＤＮＡ聚合酶、ｌｎｇ大肠杆菌基因组ＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌ的引物Ｅｃｏ－１和Ｅｃｏ－２（引物Ｅｃｏ－１和Ｅｃｏ－２的碱基序列分别示于序列表的序列号１０和１１中），且含有适于该ＤＮＡ聚合酶组分的反应液，以及 （Ｂ）反应条件：９９℃、１秒～６６℃、７秒为１个循环，进行３５个循环的ＰＣＲ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：上森隆司，佐藤好美，大川麻里子，藤田朋子，三宅一惠，武田理，佐川裕章，萩屋道雄，向井博之，浅田起代蔵，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝酒造株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]