一种白细胞介素6受体拮抗剂制造技术

已发现类似白细胞介素６（ＩＬ－６）的一组细胞激动素，即Ｏｎｃｏ－ｓｔａｔｉｎ　　Ｍ（ＯＳＭ）、白血病抑制因子（ＬＩＰ）、睫亲神经因子（ＣＮＴＦ）和白细胞介素１１（ＩＬ－１１）的配位体诱导膜分子ｇｐ１３０是其一部分的受体复合物的形成。因此有可能得出如下假定：称为位点１和位点２的两个不同的蛋白质表面与两种不同的分子结合：位点１与专一性受体结合，而位点２与ｇｐ１３０结合。利用本发明专利技术，可鉴定这些位点并分离出野生激素的变异体，它们具有更大的专一受体亲和性（激动剂和超激动剂）或对ｇｐ１３０的亲和性降低或丧失（拮抗剂和超拮抗剂）。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用膜分子gp130激活细胞生理调节机制筛选的激素的拮抗剂和超拮抗剂。正如人们所知，授予Genentec Inc.公司的专利WO 92/21029公开了一种测定生长激素和具有类似结构构象的配位体的激动剂或拮抗剂的方法。将可能的激动剂和拮抗剂与该激素的受体接触，这将引起三元复合物的形成，该三元复合物包括一分子可能的激动剂或拮抗剂和两分子所要被激动或拮抗的激素的受体。由配位体分子诱导的受体的二聚化说明该配位体具有两个不同的反应位点(位点1和位点2)，在这些位点上进行诱变处理即有可能产生激动剂或拮抗剂。现已惊奇地发现，类似于白细胞介素6(IL-6)的一组细胞激动素，即制癌蛋白M(OSM)、白血病抑制因子(LIF)、睫亲神经因子(CNTF)及白细胞介素11((IL-11)的配位体，诱导了受体复合物的形成，而膜分子gp130是其一部分。在该受体复合物中，这些细胞激动素的专一受体和膜分子gp130始终是作为共同成分存在。因此，有可能得出如下假定在这类激素中位点1和位点2与两种不同的分子结合位点1与专一受体结合，位点2与gp130结合。从下面的叙述中可以更清楚地看出，通过根据人生长激素受体(hGH)序列与所要研究的激素的受体序列之间的功能相似性构建受体复合物的三维模型，有可能对两种位点进行鉴定。通过构建携带了既包括野生型也包括突变型激素的丝状噬菌体库(如M13)，可对相对于野生型激素对专一受体具有更大亲和性的突变体(超激动剂或超拮抗剂)进行分离。这里的IL-6及WO 92/21029中所举例子的三维模型之间的差别导致以下假设螺旋A和C中的不同残基组成了位点2。按如下方式对人白细胞介素6分子进行模拟。从科学文献中所能获得的数据中知道，人白细胞介素6属于这样一类细胞激动素它具有四个螺旋，这些螺旋形成了其三维结构的核心。对人白细胞介素6的氨基酸序列进行分析以鉴定出最有可能形成螺旋的四个区。在下一阶段，在计算机化的相互作用的图解单元中对白细胞介素6分子的这四个螺旋进行模拟。开始，假定四个螺旋的定向与在生长激素或巨噬粒细胞集落刺激因子等激素中所看到的类似。为了将疏水氨基酸以最佳方式包褒在四个螺旋之间的空间中，对螺旋的相对位置进行调整。然后，模拟连接四个螺旋的环。该白细胞介素6的三维模型保证了人白细胞介素6和其两个受体低亲和性受体gp80(位点1)和gp130信号转导的高亲和性受体(位点2)之间相互反应的两个位点的鉴定。利用下述方法鉴定这两个位点。通过比较序列发现，一族造血受体的所有成员均具有一共同区域，称为细胞激动素识别区。这种序列上的相似性也说明包括两种白细胞介素6受体gp80和gp130在内的各种受体的相应部分很可能具有结构上的相似性。与这些受体结合的细胞激动素均具有(或可预测有)一种为四螺旋基质的相似结构这一观察结果强有力地支持这一假定通过细胞激动素识别区进行的这些细胞激动素及其受体之间的反应，在生物活性的复合物中一定非常类似。鉴于已通过X-射线结晶法测定了这类化合物之一(由生长激素和生长激素的二聚受体的胞外区构成的复合物)的三维结构，我们的人白细胞介素6模型使我们能够鉴定出白细胞介素6与其两个受体gp80(位点1)和gp130(位点2)反应的可能位点。它是通过与涉及生长激素的复合物相比较并假定功能上重要的氨基酸位于两种激素表面上相似的位置而实现的。下面以白细胞介素6为例，解释提供一种生产其受体复合物包括gp130的免疫系统激素的激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的方法的必要性。已知白细胞介素6是一种184个氨基酸的多肽，它属于螺旋细胞激动素类。白细胞介素6是一种由各种类型的细胞产生的多功能的细胞激动素。在例如免疫系统中的细胞、肝细胞、肾细胞、造血细胞、角质化细胞及神经元等各种类型的细胞上，白细胞介素6的功能是作为分化和生长因子。白细胞介素6的超激动剂的产生将使及在各种严重疾病的治疗中可使用比野生型白细胞介素6更低的治疗剂量。事实上，白细胞介素6在治疗乳腺癌、白血病、传染病或与产生骨髓的细胞紊乱有关的疾病方面具有重要和有希望的应用价值。另一方面，在其特征是白细胞介素6过量产生的各种疾病，如慢性自体免疫疾病、骨髓瘤/浆细胞瘤、经绝后骨质疏松症和癌血症中，人白细胞介素6的拮抗剂或超拮抗剂的产生将抑制白细胞介素6。本专利技术筛选利用膜分子gp130激活细胞生理调节机制的激素的超激动剂、拮抗剂或超拮抗剂的方法包括下列步骤—比较生长激素的氨基酸序列与该激素的序列；—比较生长激素受体的氨基酸序列与所研究激素的两种受体即激素专一性受体和gp130的序列；—在上述比较的基础上，根据生长激素受体和所研究的两种激素受体序列之间的功能相似性，构建受体复合物的三维模型；及—鉴定出分别为与专一受体反应的位点的一部分和与gp130反应的位点的一部分的野生型所研究激素的残基。所研究的激素可选自白细胞介素6(IL-6)、制癌蛋白M(OSM)、白血病抑制因子(LIF)、睫亲神经因子(CNTF)和白细胞介素11(IL-11)。为了筛选白细胞介素6的超激动剂，本专利技术的方法进一步包括下列附加步骤一产生一系列噬菌体库，它们含有以与丝状噬菌体蛋白融合的形式存在的白细胞介素6的下列野生型残基的突变Glu 42，Glu 51，Ser 52，Ser 53，Lys 54，Glu 55，Asn 63，Lys 66，Met 67，Ala 68，Glu 69，Lys 70，Asp 71，Phe170，Gln 175，Ser 176，Ser 177，Leu 181，Gln 183；—产生其每一噬菌体均具有突变的白细胞介素6序列的噬菌体库；—从表达白细胞介素6突变体的噬菌体混合群体中筛选出其对专一受体的亲和性大于野生型白细胞介素的噬菌体；—通过对从筛选的噬菌体颗粒提取的DNA进行测序而鉴定出结合受体的最佳氨基酸序列；在这种情况下，可产生一系列噬菌体库，它们含有以与M13的蛋白质pIII融合的产物形式存在的白细胞介素6的所述野生型残基的突变。本专利技术筛选白细胞介素6的拮抗剂的方法除包括上面所述的操作外还包括如下操作步骤—利用常规分子生物学技术对所研究激素的野生型残基进行突变，形成与gp130反应的部分位点(Arg30，Tyr31，Gly35，Ser37，Ala38，Ser118，Lys120，Val121，Gln124，Phe125，Gln127，Lys128和Lys129)；—对上面产生的突变体的生物活性及其与专一白细胞介素6受体的亲和性进行评估，以鉴定出其与专一受体的亲和性完整而其生物活性降低或丧失的白细胞介素6的变异体；—对作为拮抗剂的上述白细胞介素6的变异体的野生型白细胞介素6生物活性进行评估。在筛选白细胞介素6的超拮抗剂时，是将上面所述的负责拮抗剂活性的氨基酸序列的改变与负责提高白细胞介素6的专一受体的亲和性的氨基酸的改变相结合。在筛选白细胞介素6的拮抗剂或超拮抗剂的方法中，可选择下列分子生物学技术对上面所鉴定的残基进行诱变聚合酶链反应、引物延长、寡核苷酸定点诱变及其组合。本专利技术并不限于筛选白细胞介素6的激动剂、拮抗剂或超拮抗剂。相反，它扩展到利用膜分子gp130激活细胞生理调节机制的激素的激动剂、拮抗剂和超拮抗剂，这一目的是通过利用上面所述的筛选方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用膜分子ｇｐ１３０激活细胞生理调节机制的方法筛选的激素拮抗剂和超拮抗剂，所述方法包括以下操作步骤：－将生长激素的氨基酸序列与所述激素的氨基酸序列进行比较；－将生长激素受体的氨基酸序列与所述激素的两种受体，即激素专一性受 体和ｇｐ１３０的氨基酸序列相比较；－在上述比较的基础上，根据生长激素受体和所述的两种激素受体序列之间的功能相似性，构建受体复合物的三维模型；－对分别构成与专一性受体反应的位点和与ｇｐ１３０反应的位点的一部分的野生型所述激素的 残基进行鉴定，从而获得拮抗剂和超拮抗剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：R萨维诺，A拉姆，G西利布尔托，
申请(专利权)人：布安格莱荻公司分子生物学研究所，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]