来自脂肪细胞的磷脂酰肌醇多糖(PIG)结合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及来自脂肪细胞质膜的蛋白质，所述蛋白质与磷脂酰肌醇多糖具有特异的结合亲和性。其通过避开胰岛素信号传导级联而调控葡萄糖的摄入。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及源自于脂肪细胞质膜的蛋白质，所述蛋白质对磷脂酰肌醇多糖具有特异结合亲和性。已肯定地确定了磷脂和磷脂酶在跨膜信号传导传导中的作用。同样充分地建立了通过共价键连接的糖基磷酯酰肌醇(GPI)锚定蛋白而使蛋白进入细胞膜的概念，并且对于几种GPI-锚定蛋白，例如源自于人红细胞的乙酰胆碱酯酶(AchE)、大鼠Thy-1、及几种寄生虫的外被蛋白如源自于布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的变体表面糖蛋白(VSG)，已得出GPI锚的精确化学结构。脂类锚定通过由二酰基甘油或烷酰基甘油型的磷脂组成的磷脂酰肌醇(PI)而发生。其中，由于后者出现于哺乳动物锚中，且不同于存在于膜中的大量PI，因而其可以提供由GPI产生第二信使时涉及的新分子种类。由GPI进行的信号传导是人们所特别关注的，因为这些脂类锚定分子不跨越膜，但是在大部分情况下，嵌合于脂双层的外层。对于在从激素到生长因子范围内的多种内分泌及旁分泌分子，已显示出它们由GPI的细胞膜产生的信号介导释放。至今，似乎已确定了GPI参与跨膜信号传导及其在胞内的效应，但关于导致观察到的代谢效应的信号传导途径知之甚少。GPI锚定分子拥有信号传导特性这一概念，源自于早期实验，在实验中显示了胰岛素结合到其受体上从而刺激GPI水解。鉴定了模拟胰岛素对代谢酶产生某些作用的低分子量物质。所述物质具有肌醇多糖结构，且在质膜内引起胰岛素敏感的GPI水解。尽管最初认为作为肌醇多糖酶调节子的GPI前体在结构上类似于GPI膜蛋白锚，但是信号转导GPI和膜蛋白的GPI锚之间在糖部分有明显差异。GPI膜蛋白锚总是由连着磷酸乙醇胺的三甘露糖核心组成，其提供了与所结合蛋白C末端氨基酸的连接。不仅胰岛素可调节GPI水解，也观察到许多其它激素调节GPI水解。实际上在所有情况下，激素或生长因子刺激细胞都导致GPI锚定蛋白从细胞表面瞬时释放。这些激动剂的大部分受体是酪氨酸激酶受体或是与酪氨酸激酶偶联的受体。已在分子水平上确定了涉及胰岛素作用的许多蛋白质。胰岛素受体是跨膜酪氨酸激酶，当其受胰岛素结合活化时，迅速进行自身磷酸化，同时使许多胞内底物磷酸化，在这些底物中，一个或多个是50-60kDa蛋白质，包括1 5kDa脂肪酸结合蛋白Shc和胰岛素受体的几种底物蛋白质IRS-1/2/3/4。酪氨酸磷酸化后，IRS多肽作为几种Src同源性2结构域的停靠蛋白，其包括衔接分子和酶，这些酶包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-K)、Grb2、SHP2、Nck和Fyn。通过酶的p85调节亚单位产生IRS蛋白和PI 3-K间的相互作用，进而导致p110亚单位的催化活性增强。对于许多胰岛素敏感的代谢过程，包括葡萄糖转运和糖原合成的刺激，PI 3-K是必不可少的。在IRS蛋白的酪氨酸磷酸化刺激的所有情况下，这些蛋白质同时停靠至PI3-K的p85亚单位，并且，除了胰岛素与血管紧张素信号传导系统间的通讯外，这种停靠与PI 3-K活性的刺激有关。除了鉴定直接引导从胰岛素受体到下游目标的信号转导途径外，在通过胰岛素和其它激素/生长因子或不同的外源刺激物间进行的信号传导，已描绘了几种通讯，其中所述刺激物在多种细胞系统内，要么模拟(到某种程度)要么以正的或负的方式调节胰岛素代谢的和/或促有丝分裂作用。由于这些配基中无一直接活化胰岛素受体激酶，因而，它们的信号传导途径可能与胰岛素的信号传导途径在较远的信号传导阶段处汇合。这种特性由不同类型的磷脂酰肌醇多糖-肽(PIG-P)分子共有，例如对于从酵母Gce1p的糖基磷酯酰肌醇锚制备的PIG-P，其模拟胰岛素的代谢作用达到显著程度而不同时诱导胰岛素受体激酶活性。在胰岛素反应性目标细胞中，磷脂酰肌醇多糖(PIG)和PIG-肽(PIG-P)对胰岛素信号转导级联的正向作用，涉及到糖基磷酯酰肌醇(GPI)-锚定的质膜蛋白(GPI蛋白)和双酰化的非受体酪氨酸激酶从去污剂抗性的富含糖脂的高胆固醇含量的质膜筏域(rafe domain)(hcDIGs)重新分配到较低胆固醇含量的筏域(lcDIGs)。在分离的大鼠脂肪细胞中，PIG-P的主要目标定位于hcDIGs。放射性标记的PIG-P、Tyr-Cys-Asn-NH-(CH2)2-O-PO(OH)O-6Manα1-2)-2Manα1-6Manα1-4Glu N1-6Ino-1，2-(环)-磷酸(YCN-PIG)和放射性标记的用于衍生YCN-PIG的来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的经脂解GPI蛋白(lcGce1p)都以可饱和方式结合hcDIGs，但不结合lcDIGs、微粒体或全部质膜。YCN-PIG与lcGce1这两者的结合是特异的，因为过量的化学合成的未标记YCN-PIG或脂肪细胞用胰蛋白酶然后用NaCl或N-乙基马来酰亚胺(NEM)进行预处理完全破坏了其结合，这表明一种细胞表面受体识别YCN-PIG。在源自于用GPI特异的磷脂酶C预处理的脂肪细胞的hcDIGs内，PIG-P的结合显著增加，其中所述酶相当于通过脂解去除内源性配体例如GPI蛋白质/脂类。YCN-PIG结合亲和力是最高的，然后是Tyr-Cys-Asn-NH-(CH2)2-OH(YCN)和HO-PO(H)O-6Manα1(Manα1-2)-2-Manα1-6Manα1-4GluN1-6Ino-1，2-(环)-磷酸(PIG37)成分的组合，而肽变体YMN-PIG、PIG37和YCN单独表现出中亲和力和低亲和力。对于YCN-PIG与脂肪细胞的培养，依次用胰蛋白酶/NaCl处理从细胞表面释放出来的115kDa多肽使得通过NEM进行的后续标记减少。这些数据表明，在大鼠脂肪细胞中，作为GPI蛋白受体的hcDIGs的胰蛋白酶/NaCl/NEM敏感的115kDa蛋白识别模拟胰岛素的PIG(-P)。几种类型的DIGs似乎存在于相同细胞内。由标志物和结构蛋白(小窝蛋白1-3)丰富表达引起的瓶形内陷，细胞膜穴样内陷代表末期分化细胞特异的DIGs。占脂肪细胞质膜表面积20％的细胞膜穴样内陷参与受体介导的细胞摄液作用、细胞内吞作用、胞吞转运作用和信号转导。在分离的大鼠脂肪细胞中，可以辨别出表现高浮力密度(根据蔗糖密度梯度离心)的低胆固醇/小窝蛋白含量的lcDIGs和以低浮力密度为特征的高胆固醇/小窝蛋白含量的典型hcDIGs。GPI蛋白的主要级分，例如Gce1和Nuc，以及双酰化蛋白的主要级分，例如NRTK非受体酪氨酸激酶、pp59Lyn，都定位于hcDIGs。响应模拟胰岛素的刺激物例如合成的PIG或磺酰脲、格列美脲(glimepiride)，GPI蛋白和NRTKs都从hcDIGs转移位置到lcDIGs。这种重新分配不是由于缺失其脂类修饰引起的。无(PIG)或有(PIG-P)相邻的源自于GPI蛋白多肽部分的羧基末端氨基酸的极性核心多糖首基，提供处于基础状态的GPI蛋白在hcDIGs和lcDIGs之间分配的分子基础，且它们的重新分配响应于胰岛素模拟物的刺激。GPI蛋白是细胞表面抗原、胞外酶、受体或细胞粘附分子，其在从酵母菌到人的真核细胞内表达，并通过共价结合的糖基磷酯酰肌醇(GPI)脂类部分锚定于质膜外层。尽管缺少跨膜结构域，但在穿越质膜的信号转导中还是涉及到了它们。本文档来自技高网...

【技术保护点】
源自脂肪细胞质膜的蛋白质，其与磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖－肽具有特异结合亲和性，其特点是：ａ｜在磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖－肽与所述蛋白质特异结合后，能引发脂肪细胞内胰岛素受体底物１或２的ｔｙｒ磷酸化，和ｂ｜在磷脂酰 肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖－肽与所述蛋白质特异结合后，能刺激脂肪细胞摄入葡萄糖。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：G米勒，W弗里克，S佩特里，R施奈德，M乌尔曼，
申请(专利权)人：安万特医药德国有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]