产生用于筛选活性物质的经遗传修饰生物的方法技术

产生用于药物筛选的经遗传修饰生物的方法，该方法包括以下步骤：　　　　ａ）通过对生物的遗传修饰导致异源表达至少一种蛋白质或蛋白质片段，　　　　ｂ）分析改变的基因表达模式并鉴定代偿性差异调节的基因，　　　　ｃ）显型该生物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】公知异源表达靶蛋白的遗传修饰的酵母被用于药物筛选，该靶蛋白将被所测试的物质抑制。在本专利技术的范围内，异源表达指表达与该生物无关的基因，或者以改变的表达模式表达该生物的内源基因，尤其表达被增强或减弱和/或表达在时间和/或空间(例如，在其他区室中，例如在高等生物的其他组织中)上发生改变。最简单的例子是，异源表达导致酵母的可检测的修饰表型，通常为生长抑制。在本专利技术的范围内，生长抑制指增殖速度减慢和/或生长大小减小，还包括细胞死亡(凋亡或坏死)。生长抑制发生的类型还取决于该生物，因而，在酵母中，可以观察到增殖抑制或者裂解，而在最初来自多细胞生物的真核细胞中有时也可观察到调亡。如果异源表达导致该生物的行为和/或形态的改变，该改变可以从外部观察(即，表型改变)，那么该经遗传修饰生物可容易地用于药物筛选，基于物质消除或减弱该表型(例如生长抑制)的能力可以确定测试物质的效能。在将生长抑制作为修饰表型的酵母体系的实例中，优选通过简单生长试验实施效能测定，该简单生长试验也适于高通量筛选(HTS)。与未经遗传修饰生物或者不表达该异源蛋白或蛋白片段的生物相比，遗传修饰生物的可从外部观察的任何改变(形状、大小，等等)或者其行为(生长、细胞分裂速度，等等)的任何改变都被称为表型改变。因而显型(phenotyping)指造成这种改变。然而，现有技术的该方法有缺点仅仅小部分异源表达的基因产生可用于药物筛选的经遗传修饰生物的表型。因此，可以设想例如，所有异源表达的激酶中仅有约20-30％在酵母中导致可用于药物筛选的生长抑制。对于剩下的70-80％，生长抑制如此低以至于其不能用于筛选(与对照相比太小的差异导致高背景，从而导致大量假阳性)或者根本不存在生长抑制。因此，需要产生用于药物筛选的遗传改造的生物的方法，该方法没有现有技术的缺点，并且尤其适于使得某些异源表达的基因也可用于药物筛选，尤其是HTS，这些异源表达的基因在它们所异源表达的生物中不产生任何表型或者不产生任何可用于筛选的表型。根据本专利技术，通过产生用于药物筛选的经遗传修饰生物实现了该目的，该方法包括步骤a)通过该生物的遗传修饰导致异源表达至少一种蛋白质或蛋白质片段。b)优选接着测定该遗传修饰生物的表型。c)分析改变的基因表达模式并鉴定代偿性的差异调节基因。d)该生物的显型(优选结合异源表达的蛋白质或蛋白质片段，通过缺失、诱变或过表达代偿性调节的基因以增强或产生一种表型)。本专利技术基于本专利技术人的发现多数基因的异源表达的可检测表型的缺乏是基于这一事实，即作为对异源表达的蛋白质或蛋白质片段的表达的应答，经遗传修饰生物上调或下调(即代偿性差异调节)一些基因的表达。在该情况中，差异调节指与经遗传修饰生物中的调节不同或者异源表达的蛋白质或蛋白片段没有被异源表达。代偿性指差别基因调节是对蛋白质或蛋白质片段异源表达的应答。本专利技术使得可能在与简单生化模型相比，本专利技术使在细胞模型(优选酵母)中发展平台技术成为可能。使用该测定系统，例如可能从化学文库、CombiChem文库和从天然物质的提取物中鉴定抑制剂。该测定系统适于96孔、384孔或1536孔板或者细胞测试的其他常见形式。所要选择的形式部分取决于所选的生物，该选择在技术人员的能力内。本专利技术的方法尤其适于某些基因和蛋白质或蛋白质片段，与没有经遗传修饰生物或者不异源表达所述蛋白质或蛋白片段的生物相比，它们在所需生物中的异源表达不导致表型的任何可检测的修饰。可能的是，例如测定蛋白质激酶以及导致转录应答的其他基因产物。然而，其还可能应用于可检测的修饰表型，尤其如果所修饰的表型尽管是可检测的，但是由于特定原因而不适宜用于药物筛选。可以以如此方式通过显型或修饰增强所述表型，从而使该表型可用于药物筛选。因此，在本专利技术的范围内，显型指在异源表达蛋白质或蛋白质片段的经遗传修饰生物中导致或增强表型，该表型可区别于不异源表达蛋白质或蛋白质片段的生物或者没有经遗传修饰生物。适宜的生物优选为细胞，这里为真核细胞以及原核细胞，或者适于药物筛选的多细胞非人生物，例如，果蝇(Drosophila)，并优选秀丽线虫(C.elegans)。适宜的真核细胞优选为培养的细胞系，其最初得自多细胞生物(例如，3T3、CHO、HeLa)或者其他的或真核单细胞生物，尤其是酵母。酵母中尤其适宜的又是酿酒酵母(S.cerevisiae)或裂殖酵母(S.pombe)。技术人员非常熟悉酵母细胞的适宜的实验室株系或适宜的真核细胞系。适宜的蛋白质和蛋白质片段原则上是所有那些在生物中的异源表达导致内源基因的表达模式改变的蛋白质和蛋白质片段。优选所有与发现新的活性物质有关的蛋白质和蛋白质片段，本专利技术范围内尤其优选激酶、磷酸酶、GPCRs、(尤其小的)GTP酶、蛋白酶和离子通道。在本专利技术范围内，术语“药物筛选”包括使用至少一种经遗传修饰生物对一些物质的任一类型的寻找，这些物质作用于一种或多种特定靶基因和/或靶蛋白的活性。原则上，任一类型的物质在这里都是适宜的，例如，任一类型的天然物质(即天然产生的分子，尤其生物分子)以及非天然发生、合成产生的化学物质和从天然物质，尤其生物分子(例如，修饰的肽或寡核苷酸)衍生的物质/衍生物。异源表达包括通过例如导入适宜的表达载体来向生物导入外来基因或者修饰生物内源基因的表达。因此所需要的遗传修饰可以涉及修饰生物的基因组(例如，通过将稳定载体整合到基因组或者通过各种类型的诱变)，可以是附加体的或者可以仅包括导入适宜的载体，该载体需要通过一种或多种选择标记的恒定选择以便在生物中保留。最适宜的类型取决于多种因素，还取决于生物的类型，并且可以通过熟练技术人员容易地确定。异源表达涉及至少一种蛋白质或蛋白质片段，但是也可以涉及多种蛋白质或蛋白质片段。可以通过适宜的方法(PCR、RNA印迹、蛋白质印迹等)便利地验证异源蛋白质/片段的表达，之后将经遗传修饰生物的基因表达模式与缺少所述异源蛋白的表达的生物比较，并分析。该分析通过适宜的措施进行，这些措施是技术人员足够熟悉的，使用阵列(优选DNA/RNA或蛋白质微阵列(microarray)或者芯片系统尤其适于该目的。通过比较对照生物(例如，野生型生物或者仅导入空载体的生物，或者对于可诱导的系统，异源基因的表达没有被诱导的经遗传修饰生物)和表达异源基因的经遗传修饰生物的表达模式。与对照生物的表达模式相比，表现出升高或降低程度、或者根本不存在于遗传修饰生物的表达模式中的基因产物被认为是代偿性差异调节的基因，并且可用于显型所述经遗传修饰生物。显型指在经遗传修饰生物中导致或增强与野生型生物可以区别的表型(或者对于可诱导的系统，仅由异源表达蛋白质或蛋白质片段的经遗传修饰生物产生，并且在不表达该蛋白质或蛋白质片段的所述生物未诱导状态中不产生的表型)，优选该表型适于HTS药物筛选中的评估。所述导致或增强可以在例如减少或消除一种或多种代偿性上调的基因(这可以例如，通过基因组敲除一个或多个代偿性差异调节的基因或者通过诱变发生)或者增强一种或多种代偿下调的基因的表达上发生(这可以通过，例如，使用适宜的表达载体异源表达一种或多种代偿性差异下调的基因实施)。这样，可能产生生物内源的并且由异源表达基因导致的表型，该表型由于一种或多种基因的代偿性差异调节而被阻止(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：B·克勒贝尔，A·施塔德勒，R·泽尔纳，E·莱伯尔，A·尼切，
申请(专利权)人：安万特医药德国有限公司，
类型：发明
国别省市：