使用6,8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯高度敏感和连续地检测蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP酶制造技术

本发明专利技术涉及使用６，８－二氟－４－甲基－７－羟基香豆素磷酸酯（ＤｉＦＭＵＰ）检测生物学材料中的蛋白－酪氨酸－磷酸酶的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,8－二氟－4－甲基－7－羟基香豆素磷酸酯高度敏感和连续地检测蛋白酪氨酸磷 ...的制作方法
本专利技术涉及，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯，特别是在中性条件下检测蛋白酪氨酸磷酸酶的改进方法。现有技术公开了使用底物对-硝基苯基磷酸酯(p-NPP)检测蛋白酪氨酸磷酸酶活性的方法。在标准生物化学手册中可找到这些检测方法，如“Current Protocols in Protein ScienceJohn E.Coligan(主编)，Ben M.Dunn(主编)，Hidde L.Ploegh(主编)，David W.Speicher(主编)，Paul T.Wingfield(主编)；SBN0-471-11184-8；活页，不断更新；John Wiley &Sons出版”。磷酸酶的作用是从p-NPP形成对-硝基苯酚。基于其在碱性范围中的强烈黄色可用光度法检测对-硝基苯酚。然而，这个检测方法具有一些不利特征。该检测不适合于直接确定该酶的活性，因为它是根据时间-终止原理实施的。根据这个原理，在给定的一段时间过去后添加氢氧化钠溶液中断酶反应。pH增加导致所形成的对-硝基苯酚的颜色变为黄色，用光度法确定它的吸收并且是对-硝基苯酚存在量的度量。该检测原理对酶动力学研究相当详尽，例如用于确定抑制类型。由于需要大量实验点，所以不得不建立相互并列的相应数量的独立试验。此外，底物对光、温度和pH敏感。在生理pH范围内，它有缓慢分解的趋势。当pNPP用作底物时，一些待研究的酪氨酸磷酸酶在酸性范围内具有最大活性。例如，PTP1B在pH5.6显示出更大的转换值。另一方面，在生理pH7.0下，当使用pNPP作为底物时，PTP1B仅以30％的最大转换值工作。这使得需要使用相对高数量的酶，导致费用相应增加。这个检测方法的另一个不利因素是检测中存在的其它成分，如缓冲液、盐或其它物质(检测物质)，在黄色范围内有时有吸收。这需要适当的背景对照。孔雀石绿磷酸肽检测已被描述作为检测蛋白酪氨酸磷酸酶活性的另一种方法(Martin等(1985)Journal of Biological Chemistry，260，14932页和Harder等(1994)Biochemical Journal，298，395页)。在该方法中，使用孔雀石绿试剂通过光度法检测磷酸酶由其底物肽释放出的无机磷酸盐。除了由于例如杂质或pH敏感性而引起的光度测定法的不稳定性以及时间-终止方法的费时费力外，另一个缺点是不得不制备高浓度的每个磷酸酶的特定底物肽，这通常使该方法相当昂贵。3，6-荧光素二磷酸酯已被描述作为检测蛋白酪氨酸磷酸酶的另一种底物(Journal of Biomolecular Screening 4，327-334，1999)。尽管这个底物相对于上面提及的两个底物，使得能够直接测定酶活性，但是该底物的光谱性质对于在生理pH范围下实施测量仍然不是特别好。因此，本专利技术涉及检测生物学材料中蛋白酪氨酸磷酸酶的酶活性的方法，它包括a)提供生物学材料或从生物学材料获得的制品，b)提供6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯(DiFMUP)，c)在含水溶液中，使来自a)的生物学材料或从生物学材料获得的制品与来自b)的DiFMUP接触，d)通过荧光测定检测所形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素。从生物学材料获得的制品优选包括选自LAR、CD 45、PTPα、PTP1B、TCPTP、YOP、CDC 25、PTEN和SHP1，2的蛋白酪氨酸磷酸酶。从生物学材料获得的制品可以以不同的纯度级别存在。从生物学材料获得的制品可以是完整细胞、分解的细胞、富含细胞成分和/或细胞器的样品，或纯化蛋白。当接触生物学材料或从生物学材料获得的制品时，优选6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯(DiFMUP)的浓度从10至250μM。特别优选，DiFMUP的浓度是从50至100μM。生物学材料或从生物学材料获得的制品与DiFMUP的含水溶液接触的pH优选在5.0和8.0之间，特别优选在6.0和7.5之间。在一个实施方案中，再次特别优选该pH是7.0。本专利技术也涉及鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法，它包括a)提供一种化合物，b)提供生物学材料或从生物学材料获得的制品，c)提供6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯(DiFMUP)，d)在含水溶液中，使来自a)的化合物和来自b)的生物学材料或从生物学材料获得的制品和来自c)的DiFMUP彼此接触，e)通过荧光测定确定形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素的量，f)比较e)中形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素的量和对照试验中形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素的量。对照试验的特征在于，当生物学材料或从生物学材料获得的制品接触DiFMUP时，无化合物参与以上提及的步骤a)或该化合物对于所选类型的蛋白酪氨酸磷酸酶的作用是已知的。对照试验中使用的并且其对蛋白酪氨酸磷酸酶的作用是已知的所述化合物尤其可以是钒酸盐、钒有机化合物、过钒酸盐、冈田酸、NaF、dephostasin、修饰的肽或其它化合物。在鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法的各种优选实施方案中，这种改变应该包括刺激、抑制或稳定蛋白酪氨酸磷酸酶的活性。在鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法的另一个优选实施方案中，所述蛋白酪氨酸磷酸酶选自LAR、CD 45、PTPα、TC-PTP、CDC 25、PTEN、YOP、SHP1，2和PTP1B。本专利技术还涉及可以改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性并且已经用上述鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法进行了鉴定的化合物。优选该化合物具有0.1至50kDa的分子量，更优选0.1至5kDa并更优选0.1至3kDa。该化合物可以是蛋白、氨基酸、多核苷酸、核苷酸、天然产物或芳香烃化合物。本专利技术还涉及一种药物，它包含至少一种如上所述的化合物，该化合物已用鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法所鉴定。该药物还包含配制药物的辅助物质和/或聚合物添加剂。本专利技术还涉及已通过鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法进行了鉴定的可改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物在制备治疗糖尿病的药物的应用。6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酶可从商业上获得。例如，欧洲BV分子探针公司(2333 Leiden，荷兰)出售这种化学品。US 5,830,912公开了其制备。生物学材料是含有遗传信息的任何材料，它本身也可以是细菌或真菌如大肠杆菌或酿酒酵母。生物学材料也包括来自细胞培养的细胞。在来自动物或人组织的细胞的情况下，生物学材料可通过活组织检查、手术取出或使用注射器或导管取出或类似的技术获得。这样取出的细胞可以深度冷冻、纯化或进行培养。使用常规的微生物技术使细菌和酵母细胞繁殖并纯化。本领域技术人员可在“Current Protocols in Molecular Biology；主编F.M.Ansabel等，活页出版物，不断更新，2001版，John Wiley & Sons出版”中发现为此目的的适当指导。生物学材料也可以包括来自动物细胞培养的细胞。这种细胞的实例是小鼠细胞、大鼠细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测生物学材料中蛋白酪氨酸磷酸酶的酶活性的方法，它包括ａ）提供生物学材料或从生物学材料获得的制品，ｂ）提供６，８－二氟－４－甲基－７－羟基香豆素磷酸酯（ＤｉＦＭＵＰ），ｃ）在含水溶液中，使来自ａ）的生物学材料或从 生物学材料获得的制品与来自ｂ）的ＤｉＦＭＵＰ接触，ｄ）通过荧光测定检测形成的６，８－二氟－４－甲基－７－羟基香豆素。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：S韦尔特，N特纳格尔斯，S佩特里，
申请(专利权)人：安万特医药德国有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]