本发明专利技术公开了一种通式（Ⅰ）的诺氟沙星的偶联物，由诺氟沙星半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。其中ｎ为与一个牛血清蛋白分子结合的诺氟沙星的分子数，所述ｎ为整数１～２０，ＢＳＡ为牛血清蛋白，分子量范围是６．６ＫＤａ～６．９ＫＤａ。本发明专利技术还公开了所述的偶联物的制备方法，即将诺氟沙星与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物。本发明专利技术的诺氟沙星的偶联物通过免疫新西兰大白兔，制备了效价达１∶２５６，０００的抗血清，其最低检测限为０．００１ｐｐｂ。本发明专利技术具有方法简便，快速，特异，准确的特点，为制备诺氟沙星的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种喹诺酮类抗生素的偶联物及其制备方法与应用，尤其涉及一种诺氟沙星(norfloxacin)的偶联物及其制备方法与应用。属抗生素药免疫检测领域。
技术介绍
本专利技术涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书BSA牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，Sigma公司产品PBS磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline)(0.01M，pH＝7.40)Sephadex-G75葡聚糖凝胶，Sigma公司产品cBSA经乙二胺修饰的牛血清蛋白透析膜美国联合炭化(United Carbide)公司产品诺氟沙星中国兽医药品监察所EDC乙基碳二亚胺，简称EDC，Sigma公司产品诺氟沙星(norfloxacin)属于喹诺酮类抗生素。这类抗生素由于其抗菌谱广，杀菌能力强，是继土霉素之后在畜禽水产养殖中广泛应用的药物。这类药物可以有效地预防和治疗家禽细菌和霉形体疾病。诺氟沙星是其中最常用最有效的药物之一。但人们通过研究逐渐发现，喹诺酮类抗生素在动物源食品中的残留对人体有毒害。作为一种人畜共用药，喹诺酮类抗生素在食品中的残留通过食物链对人体健康危害很大。新英格兰明尼苏达州卫生署的KIRK E SMITH为首的研究小组发现，家禽使用喹诺酮类药物使弯曲杆菌产生了耐药性。根据美国疾病控制与预防中心的调查，一种由食品引起疾病的弯曲杆菌对喹诺酮类药物的耐药性由1998年的13.6％上升到1999年的17.6％。而我国尚未颁布动物源食品中残留的喹诺酮类药物的检测方法和相应标准。美国由于考虑到这类药物的交叉感染，已经开始在畜禽养殖业中禁用喹诺酮类抗生素。我国虽尚未在畜禽水产养殖业中禁用喹诺酮类抗生素，但有严格的停药期规定。随着人民生活水平的提高及我国加入WTO，对动物源食品的品质要求也越来越高，食品中药物残留的检测必将法制化，常规化。因此，研究喹诺酮类药物在食品中的残留限量和检测方法是非常必要的。在抗生素药物残留的检测中，仪器法如液相色谱和质谱以及液相质谱联用是应用最广泛的方法。这些方法准确，稳定，可靠，可以作为标准方法。但仪器法价格昂贵，费时较长，且造成有机溶剂污染，需要大型仪器设备，需要专门的技术人员，所以难于用于现场操作。酶联免疫检测法(ELISA)提供了一种极好的扫描手段。该法具有快速，准确，简易，不需要专门人员操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的，可用于常规扫描的检测方法。酶联免疫检测法的核心是需要高质量的抗体。大多数抗生素包括喹诺酮类药物都是小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之为半抗原。所以，必须把这些化合物转变成能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原(又称之为完全抗原)。经检索，国内已有诺氟沙星与牛血清白蛋白及卵清蛋白结合物的合成的研究报道，但未进行抗体制备及开发相应的试剂盒的研究。而且目前国内检测诺氟沙星药物残留的ELISA试剂盒大都购于国外，保存期限短，价格高，远不能满足检测需要，因此研究诺氟沙星的免疫原的合成及抗体制备就显得十分必要。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种能引发动物免疫系统产生针对诺氟沙星有特异反应的抗体的免疫原，即诺氟沙星(norfloxacin)的偶联物及其制备方法。同时，本专利技术还提供了所述的诺氟沙星的偶联物作为免疫原在制备诺氟沙星特异反应抗体中的应用。本专利技术的诺氟沙星的偶联物，由诺氟沙星半抗原与产生抗原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。其中上述产生免疫原性的载体物质优选是牛血清蛋白。本专利技术所述的诺氟沙星的偶联物，其结构通式如(I) 其中n为与一个牛血清蛋白分子结合的诺氟沙星的分子个数，所述n为整数1～20，BSA为牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范围是6.6KDa～6.9Kda；上述偶联物显示出如下物化特征(1)外观白色粉末固体；(2)紫外吸收光谱277nm，323nm，332nm。上述的诺氟沙星的偶联物，其中n优选为整数5～15，BSA分子量范围是6.7KDa～6.8KDa。上述的诺氟沙星的偶联物的制备方法是将诺氟沙星与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。上述的诺氟沙星的偶联物的制备方法，由如下步骤完成 (1)溶液A的制备将诺氟沙星，羟基琥珀酰亚胺，乙基碳二亚胺(EDC)，以摩尔比1∶2～8∶5～15溶解在二甲基甲酰胺中，反应生成诺氟沙星与乙基碳二亚胺的活性中间体，备用；(2)cBSA的制备在0～4℃条件下，先将乙二胺溶于pH为7.38～7.56，浓度为0.01M～0.02M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.38～7.56；以乙二胺∶BSA∶EDC的摩尔比为15～25∶1∶15～25的量称取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20℃±5℃条件下搅拌反应2～4小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0～4℃条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析70～80小时，然后改用蒸馏水透析20～30小时，每6小时更换一次透析液；在0～4℃，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH为7.38～7.56，浓度为0.01M～0.02M的磷酸缓冲溶液中，配成10.0±5.0mg/ml的溶液，备用；(4)按诺氟沙星与cBSA的摩尔比为15～50∶1量分别取溶液A和溶液B，在20℃±5℃温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应4～6小时，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析70～80小时，再改用蒸馏水透析20～30小时，每6小时更换一次透析液；然后在0～4℃下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；(6)冻干上清液，得到白色诺氟沙星的偶联物。在上述的诺氟沙星的偶联物的制备方法中步骤(1)所述诺氟沙星与羟基琥珀酰亚胺、EDC的摩尔比优选为1∶5∶10。在上述的诺氟沙星的偶联物的制备方法中步骤(2)所述乙二胺与牛血清蛋白、EDC的摩尔比优选为20∶1∶20。在上述的诺氟沙星的偶联物的制备方法中步骤(2)(3)所述的磷酸缓冲液pH优选为7.40，浓度优选为0.01M。在上述的诺氟沙星的偶联物的制备方法中步骤(4)所述的诺氟沙星与牛血清蛋白的摩尔数比优选为30∶1。本专利技术所述的诺氟沙星的偶联物作为免疫原在制备诺氟沙星特异反应抗体中的应用。利用本专利技术的技术方案可以成功地把半抗原诺氟沙星与载体蛋白特别是牛血清蛋白BSA偶联起来，从而合成了能够在动物体内引发免疫反应，产生抗体的完全免疫原——诺氟沙星的偶联物。利用本专利技术所述的诺氟沙星的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔，成功地获得了对半抗原诺氟沙星有特异反应的抗体。经ELISA实验鉴定，利用本专利技术所述的诺氟沙星的偶联物作为免疫原制备的诺氟沙星特异反应抗体，其抗血清效价达到1∶256,000，其最低检测限为0.001ppb。上述的诺氟沙星的偶联物以及高效价的诺氟沙星特异反应抗体的制备成功，为制备诺氟沙星的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。在实际应用中，把所述制备的诺氟沙星特异反应抗体镀在微孔盘内，就可以用来检验动物源食品中诺氟沙星的残留。由于本专利技术所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诺氟沙星的偶联物，由诺氟沙星半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郗日沫，卢圣欣，张玉兰，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]
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