四环素的偶联物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种通式（Ⅰ）的四环素的偶联物，由四环素半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。其中ｎ为与一个牛血清蛋白分子结合的四环素的分子数，所述ｎ为整数１～１５；ＢＳＡ为牛血清蛋白，分子量范围是６．６ＫＤａ～６．９ＫＤａ。本发明专利技术还公开了所述的偶联物的制备方法，即将四环素与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物。本发明专利技术的四环素的偶联物通过免疫新西兰大白兔，制备了效价达１∶５０，０００以上的抗血清，其最低检测限为１ｐｐｂ。本发明专利技术具有方法简便，快速，特异，准确的特点，为制备四环素的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗生素类的偶联物及其制备方法与应用，尤其涉及一种四环素(tetracycline)的偶联物及其制备方法与应用。属抗生素药免疫检测领域。
技术介绍
本专利技术涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin，简称BSA)Sigma公司产品卵清蛋白(简称OVA)Sigma公司产品磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline，简称PBS)(0.01M，pH＝7.40)透析膜bioshorp公司产品1，1’-羰基二咪唑(1，1’-carbonyldiimidazole，简称CDI)Fluka公司产品四环素Sigma公司产品羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)Sigma公司产品乙基碳二亚胺(简称EDC)Sigma公司产品对氨基苯甲酸(4-aminobenzoic acid)Fluka公司产品四环素类抗生素包括金霉素、多西环素、美他环素、土霉素和四环素等。四环素类抗生素为广谱抗生素，对革兰氏阳性和阴性细菌、立克次氏体等均有抑菌作用。其作用机理主要是和30S核糖体亚基的末端结合，从而干扰细菌蛋白质的合成。由于其口服吸收好、优良的抗菌性、稳定的药性和低廉的价格，在畜禽生产中四环素类抗生素被广泛用作药物添加剂，用于防治肠道感染和促生长，但过量使用不可避免使母体代谢产物等相关抗生素残留于动物的肌肉、蛋、奶、脏器、组织中，进而通过食物链影响人体健康。四环素类药物的毒性反应主要表现在对胃、肠、肝脏的损害，以及牙齿的染色，还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎作用。颜军等报道土霉素可导致肝脏肿大、黄疸、脂肪肝等。四环素可造成妊娠期妇女严重肝损伤，甚至死亡。在我国四环素类抗生素尤其是四环素是使用最多的药物添加剂，其在动物性食品中的残留量往往超过规定限量，对人类健康造成很大危害。随着四环素类药物研究的不断深入，特别是四环素作为保鲜剂、防腐剂等新用途的开发利用，对动物性食品中四环素残留量的分析越来越重要；再者，自从加入WTO以后，我国畜禽产品出口屡遭绿色壁垒，使贸易受阻，给整个产业造成很大的经济损失。为了应对药物残留给整个产业发展和食品安全保障所带来的挑战，我国政府和相关部门，已加大了对药物添加剂的检测力度，修订和颁布了更为严格规范的法律和规范。对畜产品生产过程进行监控和执法，一是制定最高残留限量的标准，二是改进残留分析方法和技术，发展快速、准确和高灵敏度的检测手段。在四环素类抗生素药物残留的检测中，常用的方法有仪器法如高效液相色谱法、气相色谱法、液相-质谱联用法等。这些方法准确、稳定、可靠，可以作为标准方法。但仪器法价格昂贵，费时较长，且造成有机溶剂污染，需要大型仪器设备，需要专门的技术人员，所以难于用于现场操作。酶联免疫法(ELISA)具有灵敏、快速、特异性好、样品量少，不需要专门人员操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的、可用于常规扫描的检测方法。但是酶联免疫检测法需要高质量的抗体，四环素类抗生素都是小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之为半抗原。所以必须把这些化合物转变成能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原(又称之为完全抗原)。经检索，现在世界上尚未有关于四环素的免疫原的合成及抗体制备的报道，而且目前国内检测四环素药物残留的ELISA试剂盒大都购于国外，保存期限短，价格高，远不能满足检测需要，因此研究四环素的免疫原的合成及抗体制备就显得十分必要。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种能引发动物免疫系统产生针对四环素有特异反应的抗体的免疫原，即四环素(tetracycline)的偶联物及其制备方法。同时，本专利技术还提供了所述的四环素的偶联物作为免疫原在制备四环素特异反应抗体中的应用。本专利技术的四环素的偶联物，由四环素半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。其中上述产生免疫原性的载体物质优选是牛血清蛋白。本专利技术所述的四环素的偶联物，其结构通式如(I) 其中n为与一个牛血清蛋白分子结合的四环素的分子数，所述n为整数1～15，BSA为牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范围是6.6KDa～6.9KDa；上述偶联物显示出如下物化特征(1)外观淡黄色粉末固体；(2)紫外吸收光谱276nm，320nm。在上述的四环素的偶联物中，所述n优选为整数1～10，BSA分子量范围优选是6.7～6.8KDa。上述的四环素的偶联物的制备方法是将四环素与产生免疫原的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。上述的四环素的偶联物的制备方法，具体由如下步骤完成(1)溶液A的制备将四环素与1，1’-羰基二咪唑(CDI)按摩尔比为1∶1～1∶3的比例溶在无水丙酮中，通入氮气，在氮气保护下，37℃±1℃避光反应3±1小时，反应生成四环素与1，1’-羰基二咪唑的活性中间体，备用；同时，以四环素与牛血清蛋白的摩尔数比为20∶1-35∶1的量，称取牛血清蛋白备用；(2)溶液B的制备将上述反应后的溶液A中的丙酮旋转蒸干，加入pH＝8.5±0.5，浓度为0.5M的硼砂缓冲溶液溶解生成的四环素与1，1’-羰基二咪唑的活性中间体，然后再加入上述牛血清蛋白，使牛血清蛋白的终浓度为10.0±5mg/ml，在氮气保护下，25℃±5℃避光反应30～48小时，得溶液B；(3)用pH为7.30-7.50，浓度为0.01M-0.02M的磷酸缓冲液在0-4℃下，搅拌透析溶液B 70～80小时，然后改用蒸馏水透析20～30小时，每6小时更换一次透析液；(4)冻干透析后的溶液，得到淡黄色的四环素的偶联物。在上述的四环素的偶联物的制备方法中步骤(1)所述四环素与1，1’-羰基二咪唑(CDI)的摩尔比优选为1∶2。在上述的四环素的偶联物的制备方法中步骤(1)所述四环素与牛血清蛋白的摩尔数比优选为30∶1。在上述的四环素的偶联物的制备方法中步骤(3)所述磷酸缓冲液的pH优选为7.40，浓度优选为0.01M。本专利技术所述的四环素的偶联物作为免疫原在制备四环素特异反应抗体中的应用。利用本专利技术的技术方案可以成功地把半抗原四环素与载体蛋白特别是牛血清蛋白偶联起来，从而合成了能够在动物体内引发免疫反应，产生抗体的完全免疫原——四环素的偶联物。利用本专利技术所述的四环素的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔，成功地获得了对半抗原四环素有特异反应的抗体。经酶联免疫检测实验鉴定，利用本专利技术所述的四环素的偶联物作为免疫原制备的四环素特异反应抗体，其抗血清效价达到1∶50,000以上，其最低检测限为1ppb。上述的四环素的偶联物以及高效价的四环素特异反应抗体的制备成功，为制备四环素的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。在实际应用中，把所述制备的四环素特异反应抗体镀在微孔盘内，就可以用来检验动物源食品中四环素的残留。由于本专利技术所述方法具有简易，快速，特异，准确的特点，所以可以用于食品检验检疫中的初步扫描检测之用。这样不但可以节省大量的检验时间，还可以用于现场操作，从而弥补了仪器法费时较长，需要大型仪器设备支持，需要专门的技术人员操作，难于用于现场的不足。所以，半抗原四环素与载体蛋白特别是牛血清蛋白偶联物的合成及抗血清的成功制备为这种快速检验法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种四环素的偶联物，由四环素半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郗日沫，张玉兰，卢圣欣，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]