表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法及其在制备手足口病疫苗中的应用技术

本发明专利技术实施例公开了一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法及其在制备手足口病疫苗中的应用。所述方法包括下列步骤：收集重组汉逊酵母菌体，加入细胞洗涤缓冲液洗涤重悬，离心后弃上清液；加入细胞破碎缓冲液充分重悬菌体；加入苯甲基磺酰氟溶液、聚山梨酯80和酸化玻璃珠，制备成菌体悬液；将所述菌体悬液置于细胞破碎器中振荡破碎，破碎后离心取上清液，得到细胞破碎液。实施本发明专利技术，可有效保持EV71抗原活性，操作简单，破碎率高且能够同时破碎多个样本，有效节省样本处理时间。

Cell breaking method of recombinant Hanson yeast expressing enterovirus 71 antigen and its application in the preparation of HFMD vaccine

【技术实现步骤摘要】
表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法及其在制备手足口病疫苗中的应用
本专利技术涉及基因工程重组肠道病毒71型疫苗制备技术，尤其涉及一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法及其在制备手足口病疫苗中的应用。
技术介绍
肠道病毒71型(EV71)是导致手足口病的重要病原之一。我公司构建了表达EV71抗原的重组汉逊酵母。为了对重组汉逊酵母中EV71抗原含量进行测定以监测发酵工艺的稳定性，需要对该重组汉逊酵母进行细胞破碎，释放细胞内的EV71抗原，以便对其测定。现有技术中常用的细胞破碎方法是采用高压均质机破碎，此方法耗能大，操作繁琐，破碎率低，且一次只能破碎一个样本。国内有报道称采用氧化锆珠作为研磨介质破碎汉逊酵母细胞，但破碎率只能达到50-60％，破碎过程产生大量热量且造成锆残留。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法，该方法可有效保持EV71抗原活性，操作简单，破碎率高且能够同时破碎多个样本，有效节省样本处理时间。本专利技术进一步所要解决的技术问题是，提供一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法在制备手足口病疫苗中的应用，该应用可有效保持EV71抗原活性，操作简单，破碎率高且能够同时破碎多个样本，有效节省样本处理时间。为解决上述技术问题，本专利技术公开了以下技术方案：一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法，包括下列步骤：收集重组汉逊酵母菌体，加入细胞洗涤缓冲液洗涤重悬，离心后弃上清液；加入细胞破碎缓冲液充分重悬菌体；加入苯甲基磺酰氟溶液、聚山梨酯80和酸化玻璃珠，制备成菌体悬液；将所述菌体悬液置于细胞破碎器中振荡破碎，破碎后离心取上清液，得到细胞破碎液。在一些可能的实施方式中，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：按重量计，取磷酸氢二钠3.0-3.5份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.5-9.0份，加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至7.5-8.5。在一些可能的实施方式中，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：按重量计，取磷酸氢二钠3.3-3.4份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.7-8.8份，加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至8.0。在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎缓冲液通过以下步骤制备：按重量计，取磷酸氢二钠5.5-6.5份、磷酸二氢钠一水合物1.0-1.5份、氯化钠25.0-35.0份、乙二胺四乙酸二钠0.2-0.5份、按体积计丙三醇20-80，加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至7.0-7.5。在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎缓冲液通过以下步骤制备：按重量计，取磷酸氢二钠5.9-6.0g、磷酸二氢钠一水合物1.1-1.2g、氯化钠29.0-30.0g、乙二胺四乙酸二钠0.3-0.4g、按体积计丙三醇40-60份，加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至7.4。在一些可能的实施方式中，所述重组汉逊酵母菌体的收集量为1-3份。在一些可能的实施方式中，所述苯甲基磺酰氟溶液的加入量为0.01-0.03份，浓度为150mmol/L-250mmol/L。在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的加入量为0.001-0.003份；和/或者，所述酸化玻璃珠的加入量为1-3重量份。在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎器转速为100-500rpm，振荡时间为30-60分钟；和/或者，破碎后离心转速6000-12000rpm，时间为5分钟。相应地，本专利技术还公开了如上所述的细胞破碎方法在制备手足口病疫苗中的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术的实施例通过收集菌体制备成菌体悬液；将所述菌体悬液置于细胞破碎器中振荡破碎，破碎后离心取上清液，得到细胞破碎液。从而有效保持了EV71抗原活性；对设备要求低，仅需要能提供圆周式旋转的设备就能进行破碎；破碎率高达98％，显著提高了细胞破碎率。具体实施方式下面详细描述本专利技术提供的表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法的实施例；本实施例主要包括以下步骤：一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法，包括下列步骤：收集重组汉逊酵母菌体，加入细胞洗涤缓冲液洗涤重悬，离心后弃上清液；加入细胞破碎缓冲液充分重悬菌体；加入苯甲基磺酰氟溶液、聚山梨酯80和酸化玻璃珠，制备成菌体悬液；将所述菌体悬液置于细胞破碎器中振荡破碎，破碎后离心取上清液，得到细胞破碎液。在一些可能的实施方式中，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：按重量计，取磷酸氢二钠3.0-3.5份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.5-9.0份，加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至7.5-8.5。在一些可能的实施方式中，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：按重量计，取磷酸氢二钠3.3-3.4份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.7-8.8份，加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至8.0。在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎缓冲液通过以下步骤制备：按重量计，取磷酸氢二钠5.5-6.5份、磷酸二氢钠一水合物1.0-1.5份、氯化钠25.0-35.0份、乙二胺四乙酸二钠0.2-0.5份、按体积计丙三醇20-80，加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至7.0-7.5。在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎缓冲液通过以下步骤制备：按重量计，取磷酸氢二钠5.9-6.0g、磷酸二氢钠一水合物1.1-1.2g、氯化钠29.0-30.0g、乙二胺四乙酸二钠0.3-0.4g、按体积计丙三醇40-60份，加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至7.4。在一些可能的实施方式中，所述重组汉逊酵母菌体的收集量为1-3份。在一些可能的实施方式中，所述苯甲基磺酰氟溶液的加入量为0.01-0.03份，浓度为150mmol/L-250mmol/L。在一些可能的实施方式中，所述酸化玻璃珠的加入量为1-3重量份。在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的加入量为0.001-0.003份。在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎器转速为100-500rpm，振荡时间为30-60分钟；和/或者，破碎后离心转速6000-12000rpm，时间为5分钟。本专利技术实施例提供的细胞破碎方法在制备手足口病疫苗中的应用，可采用前述实施例所描述的方法，其余与现有技术相同，不再一一赘述。与现有技术相比，本专利技术实施例的表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法具有下列优点：本方法为物理破碎方法，对EV71抗原活性无影响；本方法使用合适的破碎缓冲体系，能有效保持EV71抗原活性，为后续检测提供保障；本方法对设备要求低，操作简便，破碎率高，且能同时破碎多个样本。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法，其特征在于，包括下列步骤：/n收集重组汉逊酵母菌体，加入细胞洗涤缓冲液洗涤重悬，离心后弃上清液；/n加入细胞破碎缓冲液充分重悬菌体；/n加入苯甲基磺酰氟溶液、聚山梨酯80和酸化玻璃珠，制备成菌体悬液；/n将所述菌体悬液置于细胞破碎器中振荡破碎，破碎后离心取上清液，得到细胞破碎液。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法，其特征在于，包括下列步骤：
收集重组汉逊酵母菌体，加入细胞洗涤缓冲液洗涤重悬，离心后弃上清液；
加入细胞破碎缓冲液充分重悬菌体；
加入苯甲基磺酰氟溶液、聚山梨酯80和酸化玻璃珠，制备成菌体悬液；
将所述菌体悬液置于细胞破碎器中振荡破碎，破碎后离心取上清液，得到细胞破碎液。


2.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：
按重量计，取磷酸氢二钠3.0-3.5份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.5-9.0份，加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至7.5-8.5。


3.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：
按重量计，取磷酸氢二钠3.3-3.4份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.7-8.8份，加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至8.0。


4.如权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述细胞破碎缓冲液通过以下步骤制备：
按重量计，取磷酸氢二钠5.5-6.5份、磷酸二氢钠一水合物1.0-1.5份、氯化钠25.0-35.0份、乙二胺四乙酸二钠0.2-0.5份、按体积计丙...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟子辉，刘萌萌，王笑天，蓝小凤，雷国民，骆应宏，甘建辉，
申请(专利权)人：深圳康泰生物制品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44