grx 5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种grx 5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株及其构建方法和应用。该虫株缺失了新孢子虫谷氧还蛋白5(grx5)基因，其中缺失的grx5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。由于缺失了grx5基因，因此，该虫株具有繁殖能力和毒力显著下降的特点，接种小鼠后能够有效预防动物的新孢子虫的再感染，具有成为新孢子虫病弱毒疫苗的潜力。

A new attenuated sporozoite strain with Grx 5 gene deletion and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株及其构建方法和应用
本专利技术是关于基因工程领域，特别是关于一种grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株及其构建方法和应用。
技术介绍
新孢子虫是一种寄生于多种动物有核细胞的专性细胞内寄生原虫，新孢子虫病在世界范围内广泛流行。对牛和犬的危害尤为严重，主要造成孕畜流产、死胎以及新生幼畜的神经系统功能障碍，新孢子虫感染是引起奶牛流产的重要原因之一。尽管新孢子虫病严重威胁动物健康，给畜牧业生产造成巨大的经济损失，但尚没有有效的疫苗或药物用于新孢子虫感染的预防或者治疗。因此，构建新孢子虫弱毒虫株，对研发新孢子虫病弱毒疫苗具有重要应用价值。谷氧还蛋白5(glutaredoxin，grx5)是生物中普遍存在的重要的氧化还原酶，它与硫氧还蛋白家族一同维持着有机体内氧化还原的平衡。谷氧还蛋白以GSH作为直接电子供体，调节细胞含巯基蛋白的氧化还原状态，grx系统作为一种细胞内氧化还原态势的重要调节系统，在细胞信号转导过程中发挥重要作用。新孢子虫对氧化还原失衡十分敏感，但对它的各种氧化还原调节剂的研究还比较少。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种grx5(glutaredoxin5，谷氧还蛋白5)基因缺失的新孢子虫弱毒虫株，该虫株具有繁殖能力和毒力显著下降的特点，用该虫株免疫小鼠能有效抵抗新孢子虫的攻击，有作为新孢子虫弱毒疫苗的潜力。为实现上述目的，本专利技术提供了一种grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株(Δgrx5)，所述新孢子虫弱毒虫株中缺失的grx5基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，包括以下步骤：Nc1虫株(Neosporacaninum1)的准备：该Nc1虫株是具有grx5基因的新孢子虫野生株，所述grx5基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；质粒构建：通过PCR扩增、多片段连接获得构建所述新孢子虫弱毒虫株所需要的两个质粒，分别是pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒和grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒；以及弱毒虫株的获得：利用同源重组的方法，将所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒和所述grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒片段电转到所述Nc1虫株中，经过药物乙胺嘧啶筛选、单克隆筛选和PCR鉴定获得上述grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株。在本专利技术的一实施方式中，所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒是以pSAG1-Cas9-NcU6-sggra17为模板，将gra17靶点特异的gRNA替换为基因grx5靶点特异的gRNA所得到的。在本专利技术的一实施方式中，所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒为CRISPR/Cas9系统的CRISPR质粒，具体制备方法如下：利用ToxoDB里的EuPaGDT库，设计针对基因grx5(SEQIDNO.1)靶点特异的gRNA(即，grx5基因敲除的打靶位点)，根据所设计的基因grx5靶点特异的gRNA(即，打靶位点)序列设计引物，分别扩增出Cas9片段、新孢子虫U6启动子、T载体片段，在U6启动子下游引物以及T载体骨架的上游引物加入所述基因grx5靶点特异的gRNA；其中，扩增Cas9片段、NcU6启动子、T载体片段的引物如下：Cas9F：ATACGACTCACTATAGGGCG(SEQIDNO.2)，Cas9R：AGCTCCACCGCGGTGGCGGC(SEQIDNO.3)，NcU6F：GCCGCCACCGCGGTGGAGCT(SEQIDNO.4)，NcU6R：CAAGCATCACCAGGGAGATTAAACAACAATGTCCCTTTGG(SEQIDNO.5)，T载体F：AATCTCCCTGGTGATGCTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQIDNO.6)，T载体R：CGCCCTATAGTGAGTCGTAT(SEQIDNO.7)。在本专利技术的一实施方式中，所述grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒的制备方法如下所示：分别扩增grx5-5′UTR(5'同源臂)、grx5-3′UTR(3'同源臂)、DHFR及pUC19载体，利用多片段无缝连接试剂盒对grx5-5′UTR、grx5-3′UTR、DHFR及pUC19载体四个片段进行连接，构建质粒，然后扩增grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板备用；其中，扩增上述grx5-5′UTR、grx5-3′UTR、DHFR及pUC19载体四个片段的引物如下：grx5-5′UTRF：GAATCTCATCAGGATGCAGC(SEQIDNO.8)，grx5-5′UTRR：GATGCGGATCCAGCAGAATA(SEQIDNO.9)，grx5-3′UTRF：ACCCGCTTTCTCGTCTTCTA(SEQIDNO.10)，grx5-3′UTRR：TTCATCGACGCATGAAGGCC(SEQIDNO.11)，DHFRF：TATTCTGCTGGATCCGCATCCTAGCATGTCATTCGATTTT(SEQIDNO.12)，DHFRR:TAGAAGACGAGAAAGCGGGTACTAGTGGATCGATCCCCCG(SEQIDNO.13)，pUC19载体F:GGCCTTCATGCGTCGATGAACCTAGGGCTAGCTCTAGAAC(SEQIDNO.14)，pUC19载体R：GCTGCATCCTGATGAGATTCGCCGTCGTTTTACAACGTCG(SEQIDNO.15)。在本专利技术的一实施方式中，所述PCR鉴定过程中使用了如下两组引物：鉴定5’同源重组(5’→3’)：F：GACTGCGAGATGTACCTGCA(SEQIDNO.16)，R：ACTGCGAACAGCAGCAAGAT(SEQIDNO.17)；鉴定3’同源重组(5’→3’)：F：CAGATGTGCGTGTATCCACT(SEQIDNO.18)，R：CTGACAAAGGGAATGCGGTG(SEQIDNO.19)。在本专利技术的一实施方式中，所述单克隆筛选过程中使用了如下四组引物对单克隆进行鉴定：PCR1引物，鉴定5’同源重组(5’→3’)：F：GACTGCGAGATGTACCTGCA(SEQIDNO.20)，R：ACTGCGAACAGCAGCAAGAT(SEQIDNO.21)，PCR2引物，鉴定3’同源重组(5’→3’)：F：CAGATGTGCGTGTATCCACT(SEQIDNO.22)，R：CTGACAAAGGGAATGCGGTG(SEQIDNO.23)，PCR3引物,鉴定grx5基因的引物(5’→3’)：F：GCGAGGGCAGTTGGGATA(SEQIDNO.24)，R：CTAACAAAGGGTAGGTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株，其特征在于，所述新孢子虫弱毒虫株中缺失的grx5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株，其特征在于，所述新孢子虫弱毒虫株中缺失的grx5基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
Nc1虫株的准备：该Nc1虫株是具有grx5基因的新孢子虫野生株，所述grx5基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
质粒构建：通过PCR扩增、多片段连接获得构建所述新孢子虫弱毒虫株所需要的两个质粒，分别是pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒和grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒；以及
弱毒虫株的获得：利用同源重组的方法，将所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒和所述grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒片段电转到所述Nc1虫株中，经过药物筛选、单克隆筛选和PCR鉴定获得权利要求1所述的grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株。


3.如权利要求2所述的grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，其特征在于，所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒是以pSAG1-Cas9-NcU6-sggra17为模板，将gra17靶点特异的gRNA替换为基因grx5靶点特异的gRNA所得到的。


4.如权利要求3所述的grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，其特征在于，所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx5质粒的具体制备方法如下：
利用gRNA在线设计软件，设计针对基因grx5靶点特异的gRNA，根据所设计的基因grx5靶点特异的gRNA序列设计引物，分别扩增出Cas9片段、新孢子虫U6启动子、T载体片段，在U6启动子下游引物以及T载体骨架的上游引物加入所述基因grx5靶点特异的gRNA；其中，扩增Cas9片段、NcU6启动子、T载体片段的引物如下：
Cas9F：ATACGACTCACTATAGGGCG(SEQIDNO.2)
Cas9R：AGCTCCACCGCGGTGGCGGC(SEQIDNO.3)
NcU6F：GCCGCCACCGCGGTGGAGCT(SEQIDNO.4)
NcU6R：CAAGCATCACCAGGGAGATTAAACAACAATGTCCCTTTGG(SEQIDNO.5)
T载体F：AATCTCCCTGGTGATGCTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQIDNO.6)
T载体R：CGCCCTATAGTGAGTCGTAT(SEQIDNO.7)。


5.如权利要求2所述的grx5基因缺失的新孢子虫弱毒虫株的构建方法，其特征在于，所述grx5-5'UTR::DHFR::grx5-3'UTR同源模板质粒的制备方法如下所示：分别扩增grx5-5′UTR、grx5-3′UTR、DHFR及pUC19载体，利用多片段无缝连接试剂盒对grx5-5′UTR、grx5-3′UTR、DHFR及pUC19载体四个片段进行连接，构建质粒，然后扩增grx5-5'UT...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘群，宋星桔，刘晶，吴凯剑，许建海，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11