一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种弓形虫双基因缺失虫株的构建方法及其在作为弱毒疫苗中的应用。该弓形虫双基因缺失虫株是在弓形虫RHΔKu80虫株的基础上，利用CRISPR/Cas9基因敲除技术，同时敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因(ddi1)和紫外剪切修复蛋白23基因(rad23)两个基因，获得ΔΔddi1rad23双基因缺失虫株。通过实验证明：ΔΔddi1rad23双基因缺失虫株的生长繁殖能力和毒力明显降低，使用该虫株免疫小鼠后再次攻击强毒株能够对小鼠提供较好的保护，可有效抵抗弓形虫再次感染。本发明专利技术的弓形虫双基因缺失虫株有作为弓形虫弱毒活疫苗的潜力，为进一步研制弓形虫弱毒疫苗奠定基础。

A strain of Toxoplasma gondii with double gene deletion and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与应用，特别涉及泛素-蛋白酶体系统中的两个穿梭蛋白基因缺失的弓形虫虫株及其构建方法与在作为弓形虫弱毒疫苗中的应用。
技术介绍
龚地弓形虫(Toxoplasmagondii，简称弓形虫)是一种专性细胞内寄生原虫，隶属于顶复亚门，几乎感染所有的温血动物和人，是一种危害严重的人兽共患病原。弓形虫感染广泛，危害宿主的形式多样，对不同宿主、不同生长或生理阶段的危害程度也有很大差异。在宿主免疫力正常的情况下，大多为隐性感染；婴儿、免疫抑制患者感染弓形虫可能导致严重或致命的疾病，弓形虫感染还是导致妊娠动物和孕妇发生流产、死胎及其他繁殖生殖障碍的重要原因，在我国常有仔猪急性弓形虫病的报道。目前，弓形虫病的防治手段主要是磺胺类药物用于急性弓形虫病的治疗，但并不能彻底治愈弓形虫病。上个世纪九十年代，在欧洲有一种弱毒疫苗应用于预防绵羊弓形虫病引起的流产，但因为效果及其公共卫生问题，未能够广泛应用；迄今未见其它商品化疫苗应用于人和动物的弓形虫病预本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种弓形虫双基因缺失虫株的构建方法，包括如下步骤：抑制或沉默弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的表达，得到所述弓形虫双基因缺失虫株；/n所述DNA损伤诱导蛋白1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；/n所述紫外剪切修复蛋白23基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种弓形虫双基因缺失虫株的构建方法，包括如下步骤：抑制或沉默弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的表达，得到所述弓形虫双基因缺失虫株；
所述DNA损伤诱导蛋白1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；
所述紫外剪切修复蛋白23基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制或沉默弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的表达为敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因为将弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因均替换为抗性基因。


4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述将弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因均替换为抗性基因的方法为基于CRISPR/Cas9介导的同源重组技术。


5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)将含有抗性基因甲的同源重组片段和靶向DNA损伤诱导蛋白1基因的CAS9质粒导入弓形虫虫株中，使所述弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因替换为抗性基因甲，经过筛选和鉴定，得到缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株；
所述含有抗性基因甲的同源重组片段依次包括DNA损伤诱导蛋白1基因上游同源臂、抗性基因甲和DNA损伤诱导蛋白1基因下游同源臂；
2)将含有抗性基因乙的同源重组片段和靶向紫外剪切修复蛋白23基因的CAS9质粒导入所述缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株中，使所述缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株中的紫外剪切修复蛋白23基因替换为抗性基因乙，经过筛选和鉴定，得到缺失DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的弓形虫虫株；
所述含有抗性基因乙的同源重组片段依次包括紫外剪切修...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘群，张恒，刘晶，乌艺晗，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11