四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术实施例提供了一种四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺、四价流感病毒裂解疫苗制备方法及相关产品。所述纯化工艺包括如下步骤：1)40μm滤芯过滤澄清；2)碟式离心机离心；3)超滤浓缩；4)区带离心；5)超滤除糖；6)层析纯化；7)病毒裂解灭活；8)超滤纯化(除裂解剂与灭活剂)；9)除菌过滤得到单价原液。实施本发明专利技术，可具有更高的抗原回收率和更高纯度的血凝素抗原，更低的卵清蛋白含量，更低的杂蛋白含量，提高了鸡胚流感疫苗产率和有效率。提高了鸡胚流感疫苗产率和有效率。

【技术实现步骤摘要】
四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术涉及流感疫苗
，尤其涉及一种四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法。

技术介绍

[0002]四价流感病毒裂解疫苗基本都是通过鸡胚增殖培养制备。在鸡胚中增殖培养病毒，收获鸡胚尿囊液后，对其进行纯化，获得单价原液，混配得到四价流感病毒裂解疫苗。现有技术中，四价流感病毒鸡皮尿囊液的纯化工艺通常包括澄清、灭活、超滤浓缩、裂解、离心纯化和层析纯化、过滤除菌步骤。采用现有的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，可得到基本符合药典要求的四价流感病毒裂解疫苗的单价原液。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺、以实现具有更高的抗原回收率和更高纯度的血凝素抗原，更低的卵清蛋白含量,更低的杂蛋白含量，提高鸡胚流感疫苗产率和有效率。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术公开了以下技术方案：
[0005]一种四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于，包括如下步骤：
[0006]过滤澄清：收获鸡胚尿囊液，加入终浓度为0.125mol/L的柠檬酸钠溶液充分混匀后，经过40μm滤芯过滤；
[0007]碟式离心：对过滤后的鸡胚尿囊液经过蝶式离心机进行连续流离心，收集上清液；
[0008]对所述上清液进行超滤浓缩、区带离心、超滤除糖、层析纯化，得到纯化液；
[0009]病毒裂解灭活：在所述纯化液中加入病毒裂解剂裂解后，加入灭活剂进行灭活；
[0010]超滤纯化：对灭活液进行超滤洗滤，去除灭活剂和裂解剂，除菌过滤后，即得到单价原液。
[0011]作为一些可能的实施方式，在所述碟式离心步骤中，碟式离心机转速控制8500～9000rpm，上样速度控制在70～150L/h。
[0012]作为一些可能的实施方式，所述区带离心具体包括：
[0013]先采用蔗糖密度梯度离心法，在2000rpm时以50ml/min的流速从边孔依次泵入100ml pH7.4磷酸盐缓冲液、600ml超滤浓缩液、500ml 30％蔗糖溶液、470ml 55％蔗糖溶液，上样完成后30000rpm，4℃离心180min，然后从边孔进58％蔗糖溶液，期间通过监测紫外波长和蔗糖浓度来收取离心纯化液。
[0014]作为一些可能的实施方式，所述超滤除糖具体包括：
[0015]采用300KD超滤膜包超滤除糖后，0～3倍浓缩后用pH7.4磷酸盐缓冲液8～10倍体积洗滤；控制蛋白质含量在3000～4000μg/ml。
[0016]作为一些可能的实施方式，所述层析纯化具体包括：
[0017]以4FF凝胶为介质，pH7.4磷酸盐缓冲液平衡后，上样流速48～55cm/h，上样2个柱体积，继续用pH7.4磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度48～55cm/h，收集UV280洗脱峰，得到层析纯化液。
[0018]作为一些可能的实施方式，所述超滤浓缩具体包括：
[0019]上清液采用300KD超滤膜包进行30～50倍超滤浓缩,然后10倍体积洗滤。
[0020]作为一些可能的实施方式，所述超滤纯化具体包括：
[0021]灭活液采用30KD超滤膜包进行6～10倍超滤洗滤，去除裂解剂与灭活剂。
[0022]作为一些可能的实施方式，所述病毒裂解灭活步骤中：
[0023]所述裂解剂为终浓度为0.5％的Triton X
‑
100，裂解条件为置于2～8℃摇床中裂解1小时；
[0024]所述灭活剂为终浓度200μg的甲醛，灭活条件为室温下灭活60～72小时。
[0025]相应地，本专利技术还公开了一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，采用如上所述的四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺。
[0026]相应地，本专利技术还公开了一种四价流感病毒疫苗，通过上述方法制备得到。
[0027]本专利技术的有益效果是：
[0028]本专利技术实施例通过采用1)40μm滤芯过滤澄清；2)碟式离心机离心；3)超滤浓缩；4)区带离心；5)超滤除糖；6)层析纯化；7)病毒裂解灭活；8)超滤纯化(除裂解剂与灭活剂)；9)除菌过滤得到单价原液的技术方案，利用了一步层析两步离心三步超滤工艺制备四价流感病毒裂解疫苗的单价原液，从而达到了具有更高的抗原回收率和更高纯度的血凝素抗原，更低的卵清蛋白含量,更低的杂蛋白含量，提高了鸡胚流感疫苗产率和有效率的技术效果。
具体实施方式
[0029]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体的实施例对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。
[0030]本专利技术提供的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化方法一个实施例包括如下步骤：
[0031]过滤澄清：收获鸡胚尿囊液，加入终浓度为0.125mol/L的柠檬酸钠溶液充分混匀后，经过40μm滤芯过滤；
[0032]碟式离心：对过滤后的鸡胚尿囊液经过蝶式离心机进行连续流离心，收集上清液；
[0033]对所述上清液进行超滤浓缩、区带离心、超滤除糖、层析纯化，得到纯化液；
[0034]病毒裂解灭活：在所述纯化液中加入病毒裂解剂裂解后，加入灭活剂进行灭活；
[0035]超滤纯化：对灭活液进行超滤洗滤，去除灭活剂和裂解剂，除菌过滤后，即得到单价原液。
[0036]作为一些可能的实施方式，在所述碟式离心步骤中，碟式离心机转速控制8500～9000rpm，上样速度控制在70～150L/h。
[0037]作为一些可能的实施方式，所述区带离心具体包括：
[0038]先采用蔗糖密度梯度离心法，在2000rpm时以50ml/min的流速从边孔依次泵入100ml pH7.4磷酸盐缓冲液、600ml超滤浓缩液、500ml 30％蔗糖溶液、470ml 55％蔗糖溶液，上样完成后30000rpm，4℃离心180min，然后从边孔进58％蔗糖溶液，期间通过监测紫外
波长和蔗糖浓度来收取离心纯化液。
[0039]作为一些可能的实施方式，所述超滤除糖具体包括：
[0040]采用300KD超滤膜包超滤除糖后，0～3倍浓缩后用pH7.4磷酸盐缓冲液8～10倍体积洗滤；控制蛋白质含量在3000～4000μg/ml。
[0041]作为一些可能的实施方式，所述层析纯化具体包括：
[0042]以4FF凝胶为介质，pH7.4磷酸盐缓冲液平衡后，上样流速48～55cm/h，上样2个柱体积，继续用pH7.4磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度48～55cm/h，收集UV280洗脱峰，得到层析纯化液。
[0043]作为一些可能的实施方式，所述超滤浓缩具体包括：
[0044]上清液采用300KD超滤膜包进行30～50倍超滤浓缩,然后10倍体积洗滤。
[0045]作为一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于，包括如下步骤：过滤澄清：收获鸡胚尿囊液，加入终浓度为0.125mol/L的柠檬酸钠溶液充分混匀后，经过40μm滤芯过滤；碟式离心：对过滤后的鸡胚尿囊液经过蝶式离心机进行连续流离心，收集上清液；对所述上清液进行超滤浓缩、区带离心、超滤除糖、层析纯化，得到纯化液；病毒裂解灭活：在所述纯化液中加入病毒裂解剂裂解后，加入灭活剂进行灭活；超滤纯化：对灭活液进行超滤洗滤，去除灭活剂和裂解剂，除菌过滤后，即得到单价原液。2.如权利要求1所述的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于在所述碟式离心步骤中，碟式离心机转速控制在8500～9000rpm，上样速度控制在70～150L/h。3.如权利要求2所述的四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于，所述区带离心具体包括：先采用蔗糖密度梯度离心法，在2000rpm时以50ml/min的流速从边孔依次泵入100ml pH7.4磷酸盐缓冲液、600ml超滤浓缩液、500ml 30％蔗糖溶液、470ml 55％蔗糖溶液，上样完成后30000rpm，4℃离心180min，然后从边孔进58％蔗糖溶液，期间通过监测紫外波长和蔗糖浓度来收取离心纯化液。4.如权利要求3所述的四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺，其特征在于，所述超滤除糖具体包括：采用300KD超滤膜包超滤除糖后，0～3倍浓缩后用pH7.4磷酸盐缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏，钟礼军，贾维，胡文超，罗丹，喻浠明，
申请(专利权)人：深圳康泰生物制品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：