用于肿瘤预防的基于酵母的免疫疗法制造技术

本发明专利技术涉及用于制备免疫治疗性酵母的方法，所述免疫治疗性酵母在其壁上表达一种或多种肿瘤抗原；并且本发明专利技术还涉及能够通过实施本发明专利技术的方法获得的免疫治疗性酵母。

Yeast based immunotherapy for cancer prevention

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于肿瘤预防的基于酵母的免疫疗法
本专利技术涉及用于制备免疫治疗性酵母的方法，所述免疫治疗性酵母在其壁上表达一种或多种肿瘤抗原；并且本专利技术还涉及能够通过实施本专利技术的方法获得的免疫治疗性酵母。
技术介绍
癌症的治疗是汇集了包括免疫疗法在内的各种治疗方法的领域。在免疫疗法中，在被动免疫疗法和主动免疫疗法之间有区别，后者可能是靶向的或非靶向的。与化学疗法类型的疗法不同的是，主动免疫疗法的优点之一在于它们可以跨越血脑屏障的事实。确实，已经证明淋巴细胞能够跨血脑屏障迁移(LarochelleC.,AlvarezJI,PratA.Howdoimmunecellsovercometheblood-brainbarrierinmultiplesclerosis.FEBSLett.2011Dec1；585(23):3770-80)。除了这种跨越血脑屏障的优势之外，免疫疗法通常比传统的抗癌疗法具有更少的不利作用，这对于靶向免疫疗法来说尤其得到证实。这就是为何免疫疗法特别适用于已经高度虚弱的患者中的高级别III期或IV期转移性癌症的治疗。非靶向主动免疫疗法(例如抗PD-1抗体和/或抗CTLA4抗体)显著提高患者的中位生存期。但是，这些治疗使小百分比的患者受益，并伴有显著的免疫学副作用(如自身免疫疾病)。为了克服自身免疫疾病的风险并提高其有效性，已经开发了针对确定的肿瘤抗原的靶向主动免疫疗法。树突状细胞是这些新免疫疗法的主要参与者，因为它们可以调节针对癌细胞的先天免疫应答和适应性应答。因此，靶向主动免疫疗法的目标之一是刺激这些树突状细胞产生肿瘤反应性T淋巴细胞、杀伤性T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞。这些T淋巴细胞的作用是诱导肿瘤尺寸的消退(可以最多达到肿瘤的消失)以及诱导免疫记忆，从而限制复发。酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)已被成功地用作靶向主动免疫疗法的载体，因为它构成了用于诱导树突状细胞的极佳佐剂，这转而激活细胞毒性T淋巴细胞来破坏癌细胞。为了使树突状细胞能够得以激活，酵母必须产生要靶向的肿瘤抗原。专利US5830463描述了非致病性酵母的用途，该非致病性酵母经基因修饰以表达至少一种能够调节免疫应答的化合物，并证明了当该酵母被给予哺乳动物时，这种基因修饰酵母在刺激细胞应答和体液应答中均有效。专利US8734778描述了能够在其胞浆(cytosol)中表达多种肿瘤抗原的酵母，在注射前通过加热将该整个酵母杀死。专利申请US2008/0171059描述了在其表面而不是在胞浆中表达肿瘤抗原的酵母的用途。然而，特别是与现有的免疫治疗性酵母相比，存在对有效的和/或具有较少不良副作用的新抗癌疗法的需求。本专利技术人出乎意料地观察到，经基因修饰以在其壁上表达一种或多种肿瘤抗原并且经过透化的酵母使得可以有效地刺激针对肿瘤的细胞毒性T淋巴细胞。
技术实现思路
本专利技术的一个主题是用于制备免疫治疗性酵母的方法，所述方法包括下列步骤：a)获得基因修饰酵母，所述基因修饰酵母在其壁上表达一种或多种肿瘤抗原以及任选的用于靶向树突状细胞的蛋白或多肽；b)将所述基因修饰酵母透化以获得免疫治疗性酵母，任选地在透化步骤之前或之后使所述酵母灭活。本专利技术的另一个主题由能够通过实施根据本专利技术的制备方法而获得的免疫治疗性酵母组成。本专利技术的另一个主题涉及基因修饰并透化的免疫治疗性酵母，所述酵母在其壁上表达：(i)一种或多种肿瘤抗原，所述肿瘤抗原优选选自Melan-A、酪氨酸酶、gp100、MAGE-B1、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA11、MAGEA12、MAGEA2、MAGEA2B、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA8、MAGEA9、MAGEB1；MAGEB10、MAGEB16、MAGEB18、MAGEB2、MAGEB3、MAGEB4、MAGEB5、MAGEB6、MAGEB6B、纽约食管鳞癌抗原1(NewYorkEsophageal1antigen)(NY-ESO-1)、MAGEC1、MAGEC2、L-抗原(LAGE)、TRP-1、TRP-2、P53、KRAS、CEA、WT1、MUC1、SART3、生存素2B(SURVIVIN2B)、RNF43/TOMM34、TGFBRII、HER2/neu、BRAF、PI3K、APC、BAX、β2-微球蛋白、端粒酶或NRAS；以及(ii)任选的用于靶向树突状细胞的蛋白或多肽。本专利技术的另一个主题由包含药学上可接受的载体和根据本专利技术的免疫治疗性酵母的免疫治疗组合物组成。本专利技术的另一个主题涉及用作药物(尤其是用于癌症的治疗或预防)的根据本专利技术的酵母或根据本专利技术的组合物。具体实施方式定义“肽”意在指通常包含2至9个氨基酸的氨基酸序列。“多肽”意在指通常包含10至100个氨基酸的氨基酸序列。“蛋白”意在指通常包含超过100个氨基酸的氨基酸序列。“酵母”意在指由细胞壁、细胞质膜、细胞核和线粒体组成，能够通过出芽或分裂进行无性繁殖的任意真核微生物或任意单细胞真菌。在公知的酵母中有子囊菌纲(酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属)、担子菌纲(掷孢酵母属)和半知菌纲。术语“酵母”在单数和复数形式下被同样地理解。“基因修饰酵母”意在指这样的酵母：该酵母的基因遗传(geneticheritage)通过瞬时或永久地(transientlyordefinitively)引入一个或多个核酸序列(或转基因)而被人工修饰，从而在所述酵母中产生一种或多种肽、多肽和/或蛋白。转基因可以衍生自与基因修饰酵母相同物种的核酸序列(例如锚定多肽)、不同于基因修饰酵母的另一酵母物种的核酸序列(例如锚定多肽)或另一原核或真核物种的核酸序列(例如肿瘤抗原)。在本专利技术的上下文中，转基因可以例如编码一种或多种式(Ia)的融合蛋白：[用于靶向树突状细胞的蛋白或多肽]n-[肿瘤抗原]x-[肽接头]m-[用于锚定至基因修饰酵母的壁上的蛋白或多肽](Ia)；n等于0或1，m等于0或1，并且x是从1至300的整数，优选从1至50的整数、优选从1至9的整数、优选从1至5的整数。因此，“在其壁上表达一种或多种肿瘤抗原的基因修饰酵母”是这样的酵母：该酵母的基因遗传通过引入编码所述酵母的壁上的一种或多种肿瘤抗原(例如编码式(Ia)的融合蛋白)的一个或多个核酸序列而被人工修饰。在本说明书中，术语“基因修饰酵母”和“修饰酵母”是可互换的。“肿瘤抗原”意在指源自肿瘤蛋白并且能够触发针对肿瘤的体液免疫应答和/或细胞免疫应答的蛋白的全部或部分。有利的是，肿瘤抗原选自Melan-A、酪氨酸酶、gp100、MAGE-B1、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA11、MAGEA12、MAGEA2、MAGEA2B、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA8、MAGEA9、MAGEB1；MAGEB10、MAGEB16、MAGEB18、MAGEB2、MAGEB3、MAGEB4、MAGEB5、MAGEB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备免疫治疗性酵母的方法，所述方法包括下列步骤：/na)获得基因修饰酵母，所述基因修饰酵母在其壁上表达一种或多种肿瘤抗原以及任选的用于靶向树突状细胞的蛋白或多肽；/nb)将所述基因修饰酵母透化以获得免疫治疗性酵母，任选地在透化步骤之前或之后使所述酵母灭活。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170404 FR 17529141.一种用于制备免疫治疗性酵母的方法，所述方法包括下列步骤：
a)获得基因修饰酵母，所述基因修饰酵母在其壁上表达一种或多种肿瘤抗原以及任选的用于靶向树突状细胞的蛋白或多肽；
b)将所述基因修饰酵母透化以获得免疫治疗性酵母，任选地在透化步骤之前或之后使所述酵母灭活。


2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤a)是：获得基因修饰酵母，所述基因修饰酵母在其壁上表达一种或多种式(Ia)的融合蛋白：
[用于靶向树突状细胞的蛋白或多肽]n-[肿瘤抗原]x-[肽接头]m-[用于锚定至基因修饰酵母的壁上的蛋白或多肽](Ia)；
n等于0或1，m等于0或1，并且x是从1至300的整数，优选从1至50的整数。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤a)包括下列步骤：
a1)向酵母中引入各自包含式(IIa)或式(IIb)的核酸序列的一种或多种载体：
[编码用于寻址基因修饰酵母的壁的多肽的核酸序列]-[编码用于靶向树突状细胞的蛋白或多肽的核酸序列]n-[编码肿瘤抗原的核酸序列]x-[编码肽接头的核酸序列]m-[编码用于锚定至基因修饰酵母的壁上的蛋白或多肽的核酸序列](IIa)，n等于0或1，m等于0或1，并且x是从1至300的整数，优选从1至50的整数；
[编码用于靶向树突状细胞的蛋白或多肽的核酸序列]n-[编码肿瘤抗原的核酸序列]x-[编码肽接头的核酸序列]m-[编码用于锚定至基因修饰酵母的壁上的蛋白或多肽的核酸序列]-[编码用于寻址基因修饰酵母的壁的多肽的核酸序列](IIb)，n等于0或1，m等于0或1，并且x是从1至300的整数，优选从1至50的整数；
从而获得能够在其壁上表达一种或多种式(Ia)的融合蛋白的基因修饰酵母：
[用于靶向树突状细胞的蛋白或多肽]n-[肿瘤抗原]x-[肽接头]m-[用于锚定至基因修饰酵母的壁上的蛋白或多肽](Ia)，n等于0或1，m等于0或1，并且x是从1至300的整数，优选从1至50的整数；以及
a2)在适合于在所述基因修饰酵母的壁上表达所述融合蛋白的条件下培养所述基因修饰酵母。


4.如前述权利要求中任一项所述的制备方法，其中，所述酵母选自酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、Ogataea属或假丝酵母属，优选酵母属；优选地，所述酵母是酿酒酵母。


5.如权利要求2-4中任一项所述的制备方法，其中，锚定蛋白或多肽是在所述酵母的壁上表达的酵母蛋白或多肽，优选选自Aga2p或Sed1p。


6.如前述权利要求中任一项所述的制备方法，其中，所述基因修饰酵母用水/乙醇混合物进行透化。


7.如权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其中，所述用于靶向树突状细胞的蛋白或多肽选自：
能够特异性结合蛋白DEC-205的抗体；能够特异性结合蛋白DEC-205的抗体片段；细菌鼠疫耶尔森氏菌的纤溶酶原激活物(PLA)；或衍生自细菌鼠疫耶尔森氏菌的纤溶酶原激活物(PLA)的序列。


8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤抗原选自：
Melan-A、酪氨酸酶、gp100、MAGEA1、MAGEA10、MAGE...

【专利技术属性】
技术研发人员：克莱芒·德奥巴第，皮埃尔伊夫·诺格，
申请(专利权)人：伊诺瓦克蒂斯公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR