杆菌肽锌在抗分枝杆菌感染中的潜在应用制造技术

本发明专利技术提供了杆菌肽锌在抗分枝杆菌感染上的应用，该化合物可降低结核杆菌糖原分支酶的活性，在细菌水平上对结核分枝杆菌Ra菌株有较强的抑制作用。因此本发明专利技术提供的化合物有望成为分枝杆菌的有效抑制剂。

The potential application of bacitracin zinc in anti Mycobacterium infection

【技术实现步骤摘要】
杆菌肽锌在抗分枝杆菌感染中的潜在应用
本专利技术涉及药学的
，具体说是杆菌肽锌在抗分枝杆菌感染中的应用。
技术介绍
分枝杆菌分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三大类。结核分枝杆菌是结核病的主要致病菌，在细胞内潜伏很长一段时间并引起潜伏性结核病，如果生物体在很长一段时间内是生理上无活性的，那么它的储存糖对其存活变得非常重要。糖原是生物界最重要的储存糖之一，为宿主提供营养，此外，糖原在病原体与宿主相互作用期间起着十分重要的作用[1]。因此，研究糖原合成中的关键酶有重要意义。糖原由UDP-葡萄糖单体合成。糖原分支酶(GlgB)是葡聚糖合成中的关键酶，催化6-7个葡萄糖单元的片段从非还原端到相同的或相邻的葡萄糖链上的葡萄糖单元的C6羟基上[2]。相对于结核分枝杆菌H37Rv株,H37Ra株致病毒力弱且具备了H37Rv的免疫原性[34],与BCG相比,H37Ra株的免疫原性更为完整[5],因此，一般用H37Ra株来验证药物在细菌水平上的作用。杆菌肽锌,英文名是ZINCBACITRACIN,属多肽类抗生素，可抑制多种致病菌，尤其对革兰氏阳性菌有效，对部分革兰氏阴性菌、放线菌、螺旋体也有效[6]。但迄今为止，杆菌肽锌在抗结核分枝杆菌感染中的应用未见报道。
技术实现思路
针对相关技术中的问题，本专利技术提供杆菌肽锌在抗分枝杆菌感染中的应用。本专利技术还提供了针对结核分枝杆菌中糖原分支酶的抑制剂。本专利技术所涉及杆菌肽锌CAS号为1405-89-6，购买于上海迈瑞尔化学技术有限公司。在分子水平上，通过设立阴性对照，发现杆菌肽锌对结核分枝杆菌中的糖原分支酶有很好的抑制活性，并且在细菌水平上对结核杆菌Ra菌株也有较好的抑制作用，因此该化合物有望成为分枝杆菌的有效抑制剂。本专利技术提供一种用于抑制结核分枝杆菌的糖原分支酶(GlgB)的化合物，其活性成分为杆菌肽锌，该药物包含上述含有杆菌肽锌以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。本专利技术具有的优点和积极效果是：本专利技术针对结核分枝杆菌的糖原分支酶的抑制剂杆菌肽锌对结核分枝杆菌的糖原分支酶活性具有显著的抑制效果，在细菌水平上对结核杆菌Ra株也有较好的抑制作用。附图说明图1是杆菌肽锌对结核分枝杆菌的糖原分支酶的抑制作用示意图图2是杆菌肽锌对结核分枝杆菌的糖原分支酶的IC50的测定示意图图3是杆菌肽锌对结核分枝杆菌Ra菌株的MIC示意图具体实施方式：为了更好地说明本专利技术，下面将详述本专利技术的具体实施方式。1.结核分枝杆菌糖原分支酶(GlgB)的表达与纯化MtbGlgb的基因编号为Rv1326c，长度为2196bp，根据已公布的结核分支杆菌H37Rv全基因组序列，查询结核分枝杆菌糖原分支酶基因序列，并据此设计合适的引物，以结核分支杆菌H37Rv为模板，PCR体外扩增出目的基因片段。将目的基因和Pet-28a载体分别酶切,暴露出粘性末端，用T4连接酶连接，最后经酶切鉴定及测序，确保重组质粒的正确性。将测序无误的重组质粒转入感受态细胞,将转化子接种于液体LB培养基中，在其生长对数期加入诱导剂，诱导蛋白的表达。蛋白用镍柱，分子筛来进行纯化，最后获得较为纯净的蛋白。2.糖原分支酶的活性测定直链淀粉(购自上海迈瑞尔技术有限公司)作为底物，I2-KI作为指示剂，利用M1000Pro全波长多功能微孔板检测仪，检测在660nm处吸光度的降低。在96微孔板中进行酶抑制测定，将蛋白质和抑制剂在室温下先预孵育，然后加入底物，反应30min后，加入指示剂，并用M1000Pro全波长多功能微孔板检测仪立即在660nm处记吸光度值。所有测定都做三次平行，在整个实验中保持合适的阳性和阴性对照。抑制百分比计算如下，其中S是酶在不存在抑制剂的情况下使用的底物量，Si是酶在抑制剂存在下使用的底物量。3.化合物杆菌肽锌IC50的测定在测定IC50时，我们配置实验所需的蛋白MtbGlgB,底物直链淀粉,指示剂I2-KI及不同浓度的杆菌肽锌。与之前的操作基本一样，先将蛋白与不同浓度的抑制剂在室温下孵育后，加入底物，反应30分钟后，加入终止溶液，用M1000Pro全波长多功能微孔板检测仪在660nm处读取吸光度。我们通过Graphpadprism6.0软件拟合化合物浓度与剩余活性的量效关系曲线，得出IC50值。本专利技术涉及药学的
，具体说是杆菌肽锌在抗分枝杆菌感染中的应用，杆菌肽锌在抑制结核分枝杆菌中糖原分支酶时抑制率达95％以上,在制备抗结核分枝杆菌中糖原分支酶的小分子抑制剂方面有很大应用潜力，有望成为抗分枝杆菌感染的有效抑制剂。4.刃天青微孔板法测定化合物对(Mycobacteriumtuberculosis)的最小抑菌浓度菌液的培养：在超净台中按照一定的比例接种结核分枝杆菌H37Ra菌株中,按照比例加入7H9培养基,振荡培养,至OD600＝1.2,将其作为种子液。在超净台中以1:100的比例转接种子液到5mL7H9培养基中,振荡培养,使其生长到对数期。取菌液将其调整到OD600＝0.15,并稀释倍100使用。7H9液体培养基,菌液，和不同浓度的药物依次加入到96孔板中，每个药物浓度设3个平行,阳性对照为利福平，轻轻摇动混匀。放置于37℃培养箱培养。7天后，在超净台中加入刃天青,继续孵育4小时,于倒置放大镜上观察细菌生长情况,若由蓝色变为粉红色，则说明有菌生长。以上所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常用的方法。以上仅为本专利技术的具体实施方式，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。参考文献：[1]Lemassu,A.,andDaffe′,M.(1994)Biochem.J.297,351–357[2]Cantarel,B.L.,Coutinho,P.M.,Rancurel,C.,Bernard,T.,Lombard,V.,andHenrissat,B.(2009)NucleicAcidsRes.37,D233–238[3]JenaL,KashikarS,etal.EffectofsingleaminoacidmutationsonfunctionofMycobacteriumtuberculosisH37RvandH37Rabycomputationalapproaches[J].IndianJTuberc,2014,61(3):200-206.[4]CastanoD,GarciaLF,RojasM.Differentiationofhumanmonouclearphagocyte本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.杆菌肽锌在抗分枝杆菌上的应用。/n

【技术特征摘要】
1.杆菌肽锌在抗分枝杆菌上的应用。


2.杆菌肽锌可显著抑制结核分枝杆菌糖原分支酶的活性。


3.根据权利要求1和2所述的应用,其中,杆菌肽锌的结构式为：

。


4.一种分枝杆菌的有效抑制剂,包含权利要求1所述的化...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海涛，黄珍珍，刘祥，王泽方，陈成，蔡岩，张翅，
申请(专利权)人：天津国际生物医药联合研究院，
类型：发明
国别省市：天津;12