一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法技术

本发明专利技术公开的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，通过超低温冷冻肠道样品，以便于肠道内容物的收集和肠道粘膜的剥离，利于样品中的细菌收集；在细菌收集步骤中，通过低速离心除去样品中的组织碎片；超声波破碎收集的细菌，加入STE缓冲液除去细菌中的蛋白质和多聚糖，并加入酚氯仿溶液和氯仿异戊醇溶液进一步去除可溶性杂蛋白；最终通过异丙醇抽提获取鱼类肠道细菌群落基因组DNA。本发明专利技术提取方法采用常规实验试剂和设备，无特殊实验条件要求，可以在较短时间内获取鱼类肠道细菌群落基因组PCR扩增所需的DNA模板，操作步骤简便，重复性好，易于操作推广。该提取方法的成本低于商业化试剂盒，具有广泛的应用价值和前景。

A method of extracting genomic DNA from intestinal bacterial community of fish

【技术实现步骤摘要】
一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体是一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法。
技术介绍
细菌群落基因组DNA的提取方法主要有细胞裂解后苯酚-氯仿抽提、异丙醇纯化以及SDS沉淀法，也有采用chelex-100或碱性裂解提取法等。目前提取肠道细菌群落基因组相对较为简便的方法是采用商业化粪便或者土壤细菌群落基因组DNA提取试剂盒。通过试剂盒提取获得的基因组DNA，通常去除原有细菌群落样本中的蛋白质和脂肪酸，再通过醇类沉淀去除加入的酚类等试剂，所得DNA质量较高，可满足多数实验需求。肠道细菌群落基因组DNA是DGGE分析和建立有代表性的16SrRNA文库的基础，这些技术和方法广泛应用于多项研究和应用领域，例如对鱼类肠道细菌群落结构的多样性分析、细菌群落结构特征鉴定等。但现在没有针对鱼类肠道细菌群落基因组DNA提取的商业化试剂盒，而目前实验室培养方法只能分离纯化自然界约1％的微生物。采用分子生物学方法研究肠道环境中细菌群落，需要先克服肠道环境中细菌种类众多、成分复杂、干扰性物质影响下游实验操作等问题，因此，建立一种针对肠道环境的高效、快速的细菌群落基因组DNA提取方法是进行肠道样品细菌群落研究的基础。鱼类肠道细菌群落基因组DNA提取的目标是获取高质量的基因组DNA，保证DNA的完整性，便于进一步建立DGGE分析方法和代表性的16SrRNA文库。但是鱼类肠道环境成分十分复杂，尤其在基因组DNA提取过程中难以去除脂类、酸性物质等有机物，直接影响下游的PCR扩增、酶切反应的效果。除此之外，个体较小鱼类肠道样品含有的细菌群落数量也较少，经过细胞破裂、蛋白质等去除、DNA纯化等多个步骤，最终获取的基因组DNA浓度或者纯度较低，不足以进行下游的实验操作，目前大多基因组DNA提取方法都存在这些问题。为了解决提取鱼类肠道细菌群落基因组DNA存在的细菌裂解不完全、酶反应抑制物、DNA不完整等问题，需要一种适合鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术中细菌裂解不完全、酶反应抑制物、DNA不完整等缺陷，提供一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，该提取方法操作步骤简便，重复性好，可获得纯度和浓度较高、完整的DNA，成本低于商业化试剂盒，具有广泛的应用价值和前景。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：(1)鱼体表面用灭菌水清洗后，再用浓度70～75％酒精棉擦拭三次，无菌剖开鱼体腹腔，取出完整鱼肠道置于无菌离心管中，再将无菌离心管迅速置于-70～-80℃保存24h；(2)纵向剖开鱼肠道，收集肠道内容物，刮取肠黏膜至肠道壁呈半透明状，并将肠道内容物和肠黏膜置于1.5mL的无菌Ep管中，再向该无菌Ep管内加入0.5～1mL的STE缓冲液，浸没肠道内容物和肠黏膜；(3)将步骤(2)中装有肠道内容物和肠黏膜的无菌Ep管涡旋震荡10～20min，100～200g离心2～5min，将上清液转移至一个新的1.5mL的无菌Ep管中；(4-1)将步骤(3)中装有上清液的无菌Ep管置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400～600mV，工作2～4s，间隔3～8s，共重复40～50次；(4-2)将步骤(4-1)中无菌Ep管冰上冷却5～10min，再置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400～600mV，工作2～4s，间隔3～8s，共重复40～50次，收集破碎产物；(4-3)将步骤(4-2)收集的破碎产物，在4～8℃条件下2000～4000g离心5～8min，收集上清液，并得到沉淀；(5)在步骤(4-3)得到的沉淀中加入0.5～1mL的STE缓冲液和50～80μL的浓度为20～50mg/mL的溶菌酶，充分混匀后置于37±1℃水浴20～30min，得到混悬液；(6)将步骤(5)得到的混悬液2000～4000g离心5～8min，收集上清液，并与步骤(4-3)收集的上清液混合；(7-1)在步骤(6)混合后的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000～12000g离心5～10min，收集上清液；(7-2)在步骤(7-1)收集的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000～12000g离心5～10min，收集上清液；(8-1)在步骤(7-2)收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000～12000g离心5～10min，收集上清液；(8-2)在步骤(8-1)收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000～12000g离心5～10min，收集上清液；(9)在步骤(8-2)收集的上清液中加入0.6～1.0倍体积的预冷的80％异丙醇，-18～-20℃冰冻10～20min后，10000～12000g离心5～10min，再用100％异丙醇洗两次沉淀；(10)在步骤(9)中经100％异丙醇洗后的沉淀中加入50～100μL的TE缓冲液，室温放置2～5min，获得鱼类肠道细菌群落基因组DNA，-70～-80℃保存备用。本专利技术提取方法通过超低温冷冻肠道样品，以便于肠道内容物的收集和肠道粘膜的剥离，利于样品中的细菌收集；在细菌收集步骤中，通过低速离心除去样品中的组织碎片；超声波破碎收集的细菌，加入STE缓冲液除去细菌中的蛋白质和多聚糖，并加入酚氯仿溶液和氯仿异戊醇溶液进一步去除可溶性杂蛋白；最终通过异丙醇抽提获取鱼类肠道细菌群落基因组DNA。作为优选，以1L的STE缓冲液体积计，步骤(2)和步骤(5)中所用STE缓冲液由50～100mmol/L的Tris-HCl、50～100mmol/L的EDTA·2Na、0.5～1％的CTAB和0.8～1mol/L的NaCl组成，用NaOH调节STE缓冲液的pH值至7.5～8.5。CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性；在高离子强度的溶液中(＞0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白和多聚糖形成复合物经离心除去，可有效提高下游PCR反应的灵敏性。本专利技术在所用STE缓冲液加入CTAB提取基因组DNA，无需蛋白酶K的消化作用，也不需要柱纯化系统；CTAB与蛋白、多糖形成复合物后可离心除去，不影响后续的酶反应。作为优选，以1L的TE缓冲液体积计，步骤(10)中所用TE缓冲液由5～10mmol/L的Tris-HCl和5～10mmol/L的EDTA·2Na组成，用NaOH调节TE缓冲液的pH值至7.5～8.5。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）鱼体表面用灭菌水清洗后，再用浓度70~75 %酒精棉擦拭三次，无菌剖开鱼体腹腔，取出完整鱼肠道置于无菌离心管中，再将无菌离心管迅速置于-70~-80 ℃保存24 h；/n（2）纵向剖开鱼肠道，收集肠道内容物，刮取肠黏膜至肠道壁呈半透明状，并将肠道内容物和肠黏膜置于1.5 mL的无菌Ep管中，再向该无菌Ep管内加入0.5~1 mL的STE缓冲液，浸没肠道内容物和肠黏膜；/n（3）将步骤（2）中装有肠道内容物和肠黏膜的无菌Ep管涡旋震荡10~20 min，100~200 g离心2~5 min，将上清液转移至一个新的1.5 mL的无菌Ep管中；/n（4-1）将步骤（3）中装有上清液的无菌Ep管置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400~600 mV，工作2~4 s，间隔3~8 s，共重复40~50次；/n（4-2）将步骤（4-1）中无菌Ep管冰上冷却5~10 min，再置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400~600 mV，工作2~4 s，间隔3~8 s，共重复40~50次，收集破碎产物；/n（4-3）将步骤（4-2）收集的破碎产物，在4~8 ℃条件下2000~4000 g离心5~8 min，收集上清液，并得到沉淀；/n（5）在步骤（4-3）得到的沉淀中加入0.5~1 mL的STE缓冲液和50~80 μL的浓度为20~50mg/mL的溶菌酶，充分混匀后置于37±1 ℃水浴20~30 min，得到混悬液；/n（6）将步骤（5）得到的混悬液2000~4000 g离心5~8 min，收集上清液，并与步骤（4-3）收集的上清液混合；/n（7-1）在步骤（6）混合后的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；/n（7-2）在步骤（7-1）收集的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；/n（8-1）在步骤（7-2）收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；/n（8-2）在步骤（8-1）收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；/n（9）在步骤（8-2）收集的上清液中加入0.6~1.0倍体积的预冷的80%异丙醇，-18~-20 ℃冰冻10~20 min后，10000~12000 g离心5~10 min，再用100%异丙醇洗两次沉淀；/n（10）在步骤（9）中经100%异丙醇洗后的沉淀中加入50~100 μL的TE缓冲液，室温放置2~5 min，获得鱼类肠道细菌群落基因组DNA，-70~-80 ℃保存备用。/n...

【技术特征摘要】
1.一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）鱼体表面用灭菌水清洗后，再用浓度70~75%酒精棉擦拭三次，无菌剖开鱼体腹腔，取出完整鱼肠道置于无菌离心管中，再将无菌离心管迅速置于-70~-80℃保存24h；
（2）纵向剖开鱼肠道，收集肠道内容物，刮取肠黏膜至肠道壁呈半透明状，并将肠道内容物和肠黏膜置于1.5mL的无菌Ep管中，再向该无菌Ep管内加入0.5~1mL的STE缓冲液，浸没肠道内容物和肠黏膜；
（3）将步骤（2）中装有肠道内容物和肠黏膜的无菌Ep管涡旋震荡10~20min，100~200g离心2~5min，将上清液转移至一个新的1.5mL的无菌Ep管中；
（4-1）将步骤（3）中装有上清液的无菌Ep管置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400~600mV，工作2~4s，间隔3~8s，共重复40~50次；
（4-2）将步骤（4-1）中无菌Ep管冰上冷却5~10min，再置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400~600mV，工作2~4s，间隔3~8s，共重复40~50次，收集破碎产物；
（4-3）将步骤（4-2）收集的破碎产物，在4~8℃条件下2000~4000g离心5~8min，收集上清液，并得到沉淀；
（5）在步骤（4-3）得到的沉淀中加入0.5~1mL的STE缓冲液和50~80μL的浓度为20~50mg/mL的溶菌酶，充分混匀后置于37±1℃水浴20~30min，得到混悬液；
（6）将步骤（5）得到的混悬液2000~4000g离心5~8min，收集上清液，并与步骤（4-3）收集的上清液混合；
（7-1）在步骤（6）混合后的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000~12000g离心5...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈丽琴，袁勇军，管峰，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33