用于转导和扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物技术

本公开提供用于以基因方式修饰淋巴细胞的方法及用于执行包括转导T细胞和/或NK细胞的过继性细胞疗法的方法。所述方法可包括抑制性RNA分子和/或可包括淋巴增生性组件的工程化信号传导多肽和/或嵌合抗原受体(CAR)，例如受微环境限制的生物CAR(MRB‑CAR)。本文中提供此类工程化信号传导多肽的额外组件，诸如驱动增生的那些组件及用于其的调节组件，以及复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及包装细胞系以及其制造方法。提供用于调节经转导和/或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的许多组件及方法，例如，包括核糖开关、MRB‑CAR、识别域和/或pH调节剂的组件和方法。

Methods and compositions for transduce and amplify lymphocytes and regulate their activity

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于转导和扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物相关申请的交叉参考本申请为：2017年3月19日提交的国际申请第PCT/US2017/023112号的部分继续申请；2017年7月8日提交的国际申请第PCT/US2017/041277号的部分继续申请；2017年3月19日提交的美国申请第15/462,855号的部分继续申请；以及2017年7月8日提交的美国申请第15/644,778号的部分继续申请；并主张以下申请的权益：2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号；2017年9月18日提交的美国临时申请第62/560,176号；2017年9月27日提交的美国临时申请第62/564,253号；以及2017年9月28日提交的美国临时申请第62/564,991号；国际申请第PCT/US2017/023112号主张2016年3月19日提交的美国临时申请第62/390,093号、2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号以及2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益；国际申请第PCT/US2017/041277号主张2017年3月19日提交的国际申请第PCT/US2017/023112号、2017年3月19日提交的美国专利申请第15/462,855号、2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号以及2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益；美国申请第15/462,855号主张2016年3月19日提交的美国临时申请第62/390,093号、2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号以及2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益；且美国申请第15/644,778号为2017年3月19日提交的国际申请第PCT/US2017/023112号的部分继续申请及2017年3月19日提交的美国专利申请第15/462,855号的部分继续申请，且主张2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号及2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益。这些申请以全文引用的方式并入本文中。序列表本申请在此以引用方式并入与本申请一起提交的电子序列表的材料。该电子序列表中的材料作为在2018年3月3日创建的标题为“F1_001_WO_03_Sequence_Listing_2018_03_03.txt”的文本(.txt)文件(其文件大小为526KB)提交，且以全文引用的方式并入本文中。
本专利技术涉及免疫学领域，或更具体地，涉及T淋巴细胞或其他免疫细胞的基因修饰，以及制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及控制其中基因表达的方法。
技术介绍
从受试者(例如，患者)分离的淋巴细胞可在体外活化且经基因修饰以表达合成蛋白，这些合成蛋白能够基于所合并的基因程序而与其他细胞及环境重新定位结合。这种合成蛋白的一个实例为嵌合抗原受体(CAR)。目前使用的一种CAR为胞外识别域(例如，抗原结合域)、跨膜域及由复制缺陷型重组反转录病毒编码的一个或多个胞内信号传导域的融合。尽管重组反转录病毒已在感染非分裂细胞上显示出功效，但静息CD4及CD8淋巴细胞对这些载体的基因转导不敏感。为了克服这些困难，通常在可出现带有CAR基因载体的基因修饰之前，使用刺激剂来在体外活化这些细胞。在刺激及转导之后，经基因修饰的细胞在体外扩增且随后再引入至淋巴消耗(lymphodeplete)的患者中。在体内抗原结合之后，CAR的胞内信号传导部分可在免疫细胞中启动活化相关的反应并释放细胞溶解分子以诱导肿瘤细胞死亡。目前这些方法需要大量的操作及在T细胞再输注至患者中之前在体外制造增生性T细胞，以及淋巴消耗化学疗法以释放细胞因子及消耗竞争性受体以有助于T细胞移植。一旦引入至身体中，这些CAR疗法还不能控制体内传播速率，也不能安全地定向同样在肿瘤外表达的靶标。因此，现今CAR疗法一般由使用1×105个细胞/千克至1×108个细胞/千克的剂量离体扩增12天至28天的细胞输注，且定向靶标(例如，肿瘤靶标)，对于该CAR疗法离开肿瘤在靶标毒性上一般是可接受的。这些相对较长离体扩增时间产生细胞存活性及无菌性问题，以及包括可扩增性的挑战在内的样本一致问题。因此，亟需一种更安全、更有效的可扩增的T细胞或NK细胞疗法。由于我们对驱动淋巴细胞的转导、增生和存活的过程的理解为涉及免疫过程的各种潜在商业用途的核心，因此需要经改进方法及组合物以供研究淋巴细胞。举例而言，其将有助于鉴别可用于更好的表征及理解淋巴细胞可如何经基因方式修饰的方法及组合物以及影响其存活及增生的因素。此外，其将有助于鉴别驱动淋巴细胞增生及存活的组合物。这些组合物可用于研究对这些过程的调节。除用于研究淋巴细胞的方法及组合物以外，需要经改进病毒包装细胞系及其制造及使用的方法。举例而言，这些细胞系及方法将适用于分析重组病毒(诸如重组反转录病毒颗粒)的不同组分，以及用于使用包装细胞系以供生产重组反转录病毒颗粒的方法。
技术实现思路
本文中提供帮助克服涉及用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞)的方法、组合物及试剂盒的有效性及安全性问题。这些方法的某些实施例适用于用这些细胞进行过继性细胞疗法。因此，在一些方面，本文中提供用于以基因方式修饰和/或转导淋巴细胞(尤其T细胞和/或NK细胞)和/或用于调节经转导和/或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的方法、组合物及试剂盒。这些方法、组合物及试剂盒提供优于目前技术的改进的功效及安全性，尤其关于表达嵌合抗原受体(CAR)及在说明性实施例中微环境限制生物CAR的T细胞和/或NK细胞。利用本文提供的方法和/或使用该方法生产的经转导和/或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞包括，在经由反转录病毒(例如，慢病毒)颗粒自反转录病毒(例如，慢病毒)基因组递送的说明性实施例中，为此类细胞及为利用此类细胞的方法(诸如研究方法、商业生产方法及过继性细胞疗法)提供经改进特征的功能性及功能性组合。举例而言，这些细胞可离体在较短时间内产生，及这些细胞具有可被更好调节的经改进的生长特性。在一些方面，本文中提供用于调节CAR、mRNA、抑制性RNA的表达的调节组件，和/或在淋巴细胞(诸如B细胞、T细胞及NK细胞)中的淋巴增生性组件，例如嵌合淋巴增生性组件。此外，在一些方面，本文中提供表达各种功能组件且在其表面上携载各种功能组件的重组反转录病毒，以及用于生产这些重组反转录病毒的方法及包装细胞系。这些重组反转录病毒及用于生产其的方法及细胞克服了先前技术关于基因组数目及大小的限制，具有在递送至T细胞和/或NK细胞中时提供益处的不同功能组件。在一些方面，提供用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞)的方法，且在说明性实施例中，提供用于转导和/或以基因方式修饰静息T细胞和/或NK细胞的离体方法。这些方面中的一些方面可比先前方法快速得多地进行，可有助于更有效的研究、更有效的商业生产以及经改进的患者护理方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制备用于以基因方式修饰受试者的静息T细胞或静息NK细胞的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的用途包含：使所述T细胞或NK细胞离体与所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含表面上的假型组件及所述表面上的膜结合T细胞活化组件，其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导所述T细胞或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，且其中所述接触进行1小时至12小时之间。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170303 US 62/467,039;20170319 US 15/462,855;20171.一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制备用于以基因方式修饰受试者的静息T细胞或静息NK细胞的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的用途包含：使所述T细胞或NK细胞离体与所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含表面上的假型组件及所述表面上的膜结合T细胞活化组件，其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导所述T细胞或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，且其中所述接触进行1小时至12小时之间。


2.根据权利要求1所述的用途，其中所述接触进行1小时至6小时之间。


3.根据权利要求1所述的用途，其中所述膜结合T细胞活化组件为抗CD3scFvFc。


4.根据权利要求1所述的用途，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽，且其中所述经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在针对所述CAR的ASTR的靶标且不存在外源性细胞因子的情况下在离体培养物中存活至少7天。


5.根据权利要求4所述的用途，其中所述T细胞淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。


6.根据权利要求5所述的用途，其中所述嵌合细胞因子受体包含连接至IL-7受体α的IL-7，或其保留促进T细胞和/或NK细胞增生的能力的片段，且其中所述嵌合细胞因子受体是组成性活性的。


7.根据权利要求6所述的用途，其中所述嵌合细胞因子受体包含共价连接至能够结合IL-7的IL-7受体的功能性胞外片段、IL-7受体跨膜域及IL-7受体信号传导域的IL-7。


8.根据权利要求4所述的用途，其中所述CAR为MRB-CAR。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒，且其中所述经基因方式修饰的细胞为经基因方式修饰的T细胞。


10.一种经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其通过根据包含使静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的方法转导静息T细胞和/或静息NK细胞来制得，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的膜结合T细胞活化组件，其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导所述静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，且其中所述接触进行1小时至12小时之间。


11.根据权利要求10所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述接触进行1小时至6小时之间。


12.根据权利要求10所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述膜结合T细胞活化组件为抗CD3scFvFc。


13.根据权利要求10所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽，且其中所述经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在针对所述CAR的ASTR的靶标且不存在外源性细胞因子的情况下在离体培养物中存活至少7天。


14.根据权利要求13所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述CAR为MRB-CAR。


15.根据权利要求13所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述多核苷酸进一步包含Kozak相关序列、WPRE组件及多重终止序列中的一者或多者。


16.根据权利要求13所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述T细胞淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。


17.根据权利要求10至16中任一项所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒，且其中所述经基因方式修饰的细胞为T细胞。


18.一种使用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞的方法，其包含：
A.将包装细胞悬浮培养在无血清培养基中，其中所述包装细胞包含编码所述复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组、REV蛋白质、gag多肽、pol多肽及假型组件的核酸序列；
B.从所述无血清培养基采集所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒；以及
C.使所述淋巴细胞与所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中所述接触进行少于12小时，由此转导所述淋巴细胞。


19.根据权利要求18所述的方法，其中所述包装细胞进一步包含编码活化组件的核酸。


20.根据权利要求19所述的方法，其中所述活化组件为抗CD3抗体。


21.根据权利要求20所述的方法，其中所述抗CD3抗体为抗CD3scFvFc。


22.根据权利要求18所述的方法，其中所述包装细胞为包含稳定整合于其中的编码所述可包装RNA基因组的核酸的永生化细胞。


23.根据权利要求18所述的方法，其中所述gag多肽及所述pol多肽由一种或多种可诱导启动子表达且其中所述方法进一步包含：在所述培养期间添加反式激活因子以诱导从所述一种或多种可诱导启动子表达所述gap多肽及所述pol多肽。


24.根据权利要求18所述的方法，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽。


25.根据权利要求24所述的方法，其中所述CAR为MRB-CAR。


26.根据权利要求18所述的方法，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码淋巴增生性组件。


27.根据权利要求18所述的方法，其中所述接触进行1小时至12小时之间。


28.根据权利要求18所述的方法，其中所述淋巴细胞能够在不存在任何外源性细胞因子的情况下在体外扩增。


29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞为静息T细胞且其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。


30.一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含：
A.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体(CAR)；及
B.在其表面上的假型组件及T细胞活化组件，其中所述T细胞活化组件不由所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码，且其中所述T细胞活化组件为抗CD3scFvFc抗体。


31.根据权利要求30所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型反转录病毒颗粒进一步包含能够结合至CD28的膜结合多肽。


32.根据权利要求30所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述抗CD3scFvFc抗体与异源GPI锚定连接序列融合。


33.根据权利要求30所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述一个或多个转录单元进一步编码淋巴增生性组件。


34.根据权利要求33所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述CAR和所述淋巴增生性组件表达为分离的多肽。


35.根据权利要求34所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述淋巴增生性组件为嵌合淋巴增生性组件。


36.根据权利要求35所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述嵌合淋巴增生性组件为组成性...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷戈里·伊恩·弗罗斯特，詹姆斯·约瑟夫·奥努弗，吉亚贝·H·古比加，法扎德·哈里扎德，
申请(专利权)人：F一肿瘤医学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US