一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法技术

本发明专利技术公开了一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，属于植物生物技术领域。以田菁黄化苗为材料，优化操作后获得的田菁组织提取液通过调整后的转速离心去除杂质，分离并富集粗制的线粒体，经过蔗糖梯度离心法对线粒体进行纯化，再次通过离心富集纯化后的线粒体。利用改良后的SDS法提取的线粒体DNA其A260/A280约为1.80～1.88，限制性内切酶EcoR I酶切后条带清晰，说明本方法提取的线粒体DNA纯度高。利用该发明专利技术所公开的方法能够简单快捷的提取到纯净的田菁线粒体DNA，为田菁线粒体基因组及其内部基因的分子机理研究奠定了基础。

An effective method for mitochondrial and DNA extraction of Sesbania

【技术实现步骤摘要】
一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法一、
本专利技术涉及植物生物
，具体涉及田菁线粒体及其DNA的有效提取方法，适用于田菁线粒体及其DNA的分离纯化。二、
技术介绍
线粒体是半自主细胞器，在真核生物中，通过氧化磷酸化过程为细胞提供ATP。线粒体基因组具有进化缓慢、序列插入缺失频繁、重组迅速、结构复杂多样和基因表达模式独特等特点(SchusterandBrennicke1994；SanchezPuertaetal.2017；Kovaretal.2018；SanchezPuertaetal.2019；Zhangetal.2019)。植物线粒体基因组的大小变化范围较大，从187kb到2400kb均有分布(BentolilaandStefanov，2012)。线粒体与细胞核、质体之间的序列交换及其自身重复序列的含量对线粒体基因组大小影响很大(SternandLonsdale1982；Vaughnetal.1995；Goremykinetal.2012；Christensen2014；WynnandChristensen2019)。植物在有氧呼吸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)将田菁种子进行暗培养，需要照明时使用绿光灯，利用研磨缓冲液将定量田菁黄化苗破碎，先后通过纱布和尼龙网过滤获得组织匀浆液；/n2)匀浆液通过差速离心去除组织碎片和细胞核，利用DNase I去除线粒体溶液中DNA，获得粗制线粒体；/n3)粗制线粒体利用缓冲液重悬后，转移至由蔗糖铺成的不连续密度梯度液上，经过超高速离心，获得纯化的线粒体；/n4)利用改良的SDS方法提取线粒体DNA，获得无蛋白和RNA污染的高纯度DNA；/n5)对提取的田菁线粒体DNA进行浓度检测、电泳条带检测和纯度检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将田菁种子进行暗培养，需要照明时使用绿光灯，利用研磨缓冲液将定量田菁黄化苗破碎，先后通过纱布和尼龙网过滤获得组织匀浆液；
2)匀浆液通过差速离心去除组织碎片和细胞核，利用DNaseI去除线粒体溶液中DNA，获得粗制线粒体；
3)粗制线粒体利用缓冲液重悬后，转移至由蔗糖铺成的不连续密度梯度液上，经过超高速离心，获得纯化的线粒体；
4)利用改良的SDS方法提取线粒体DNA，获得无蛋白和RNA污染的高纯度DNA；
5)对提取的田菁线粒体DNA进行浓度检测、电泳条带检测和纯度检测。


2.根据权利要求1所述的一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步骤1)中，由于苗期生长速度的限制，采用培养2周的田菁作为线粒体提取材料，包括上下胚轴和叶片；在研磨缓冲液中加入半胱氨酸和β-巯基乙醇，降低线粒体的氧化损伤；匀浆液先用2层无菌的脱脂纱布过滤，再用2层100目的尼龙网过滤，在冰上收集滤液。


3.根据权利要求1所述的一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步骤2)中，匀浆液在高速离心机中离心15min，转速2200g；将上清液再次高速离...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺亭亭，邢锦城，洪立洲，
申请(专利权)人：江苏沿海地区农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32