一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法，主要包括两个过程：(1)利用ARTP对微藻进行诱变处理，通过调节诱变时间对诱变效果的影响，以致死率为依据确定最佳的诱变时间；(2)将在各诱变时间下诱变后的藻液进行梯度稀释(可高效准确计数)。均匀涂布于固体培养基上并在光照培养箱内倒置培养。培养10天后，挑选出颜色深，直径较大的藻落接种到液体培养基中，通过测定藻液的吸光度及经尼罗红染色后的中性油脂荧光值，可掌握微藻的细胞增殖速率与油脂积累的情况，通过两种基础指标及二者的乘积综合筛选，能够更好的筛选出高产油脂的诱变藻株，进一步提高微藻制备生物柴油可能性。

A method of mutation and screening microalgae with high oil yield by ARTP

【技术实现步骤摘要】
一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法。
技术介绍
由于化石燃料的不可再生性，以及其燃烧对环境的影响，清洁燃料和可再生新能源引起了当今世界各国的广泛关注。生物质能源是地球上最普遍的一种可再生能源，它是通过植物光合作用，将太阳能以化学能的形式储存在生物体内的一种能量形式，被称为绿色能源。生物柴油是指来自生物体的油脂经转酯作用而形成的脂肪酸甲酯或乙酯，是一种生物质液体燃料，近年来已成为生物质能源研究中的热点。目前，制约生物柴油发展的关键问题是原料严重不足，微藻具有种类多、生长速率快、固碳能力强、生长环境要求低等诸多优势而被认为是最有潜力替代传统化石燃料的生物资源。但是，不同藻种的生物量及油脂含量各不相同，生物量产率和油脂含量并非正相关，如四尾栅藻在培养过程中虽然生物量可以达到很高水平，但其油脂含量呈现较低趋势；另外，在环境胁迫时，小球藻生物量表现出较低水平，但是油脂含量却较高。因此单一的选择高生物量或高油脂含量的突变藻株不能充分地发挥微藻生物质能源的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法，其特征在于，该方法中藻液先经ARTP诱变获得多种性状突变体，再经筛选获得目标性状-高产油量的藻株，具体包括如下步骤：/n(1)将待诱变藻液至对数期的微藻藻液；/n(2)等离子体诱变参数信息的确定，包括电压、电流、通气流量及诱变距离；/n(3)设置不同诱变时间对微藻藻液进行诱变；/n(4)将诱变过的藻液转移到事先配好的经过灭菌后的含10％的甘油和培养液的混合溶液中，使得甘油最终的浓度为5％，培养液以下简称为BG-11；/n(5)将藻液稀释并均匀涂布于固体培养基上，并以未诱变藻液涂布平板做空白对照；/n(6)在恒温光照培养箱内倒置培养观察，培养至...

【技术特征摘要】
1.一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法，其特征在于，该方法中藻液先经ARTP诱变获得多种性状突变体，再经筛选获得目标性状-高产油量的藻株，具体包括如下步骤：
(1)将待诱变藻液至对数期的微藻藻液；
(2)等离子体诱变参数信息的确定，包括电压、电流、通气流量及诱变距离；
(3)设置不同诱变时间对微藻藻液进行诱变；
(4)将诱变过的藻液转移到事先配好的经过灭菌后的含10％的甘油和培养液的混合溶液中，使得甘油最终的浓度为5％，培养液以下简称为BG-11；
(5)将藻液稀释并均匀涂布于固体培养基上，并以未诱变藻液涂布平板做空白对照；
(6)在恒温光照培养箱内倒置培养观察，培养至10d后，分别对固体培养基上的诱变藻株和对照藻株进行计数并以确定各个诱变时间下的经ARTP诱变后的致死率；
(7)用灭菌后的接种环挑选直径较大，颜色较深的突变藻株，并接种于含BG-11培养基的6孔培养板中，并置于恒温光照培养箱内进行分批培养；
(8)对6孔板内培养的微藻分别测定其在第三天和第八天的吸光度OD680及经尼罗红染色后的油脂荧光值，以获得各突变藻株的比生长速率和相对荧光值，用来评估各突变藻株的增殖快慢及油脂积累情况；
(9)建立了三指标的筛选原则，通过以比生长速率、相对荧光值以及比生长速率和相对荧光值的乘积值为筛选指标来获得高油脂产量的突变体；
(10)确定了比生长速率大于正常株的10％，且相对荧光值大于正常株20％为第一筛选原则；以比生长速率和相对荧光值的乘积值大于对照株的35％第二筛选原则，补漏筛选高比生长速率突变体或高相对荧光值突变体；
(11)对筛选出的优势藻株进行传代培养，测定其比生长速率和相对荧光值的变化，利用SPSS数据统计分析确定传代培养的差异是否显著，差异不显著即传代培养性状较为稳定，满足高油脂基因的遗传稳定表达；
(12)通过组合筛选方式确定出油脂产量高的藻株，并进行油脂基因表达测定，最终确定高油脂基因表达的突变体并对其进行扩大培养，以进行后续制备生物柴油的研究。


2.根据权利要求1所述的一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法，其特征在于，步骤(1)中藻液预处理的方法为：微藻的最适诱变期为对数期，细胞浓度为106个/毫升，该浓度下的细胞活力强更易于发生突变；并将5mL培养基和与同体积5mL10％甘油混合，甘油最终浓度为5％，以作为诱变后的保护营养液。


3.根据权利要求1所述的一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法，其特征在于，步骤(2)中诱变仪控制电源输入电压120V，电流1A，通入的空气流量为5L/min，诱变距离调节为2mm。


4.根据权利要求1所述的一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法，其特征在于，步骤(3)中对藻液进诱变的处理时间为0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、65s、70s；诱变前用酒精擦拭等离子体下方的载物台，并利用事先经过灭菌的盖子存放待诱变藻液并置于载物台上，调节盖子与等离子体装置出射口之间的距离为2mm；设置等离子体电压120V，电流1A，通...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙昕，李鹏飞，黄峰，王瑾，
申请(专利权)人：西安建筑科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61