The invention relates to a high-throughput screening method of gentamicin high-yield strain based on ARTP compound mutation technology, including the steps of spore suspension preparation, ARTP mutation compound mutation, rapid detection of product, preliminary screening of gentamicin high-yield strain, re screening to obtain high-yield strain preservation and high-yield strain stability inspection. Compared with the prior art, the invention utilizes the principle that OPA reacts with gentamicin to form a characteristic absorption peak at about 330nm, and realizes the rapid determination of OD value through the enzyme labeling instrument, thus successfully realizing the rapid detection of gentamicin. It overcomes the problems of poor specificity and interference of fermentation liquor color caused by precipitation of phosphotungstic acid and gentamicin. The invention has the advantages of high speed, high throughput, convenient operation, accuracy, etc., greatly improves the efficiency of gentamicin mutation breeding and screening, and greatly improves the probability of obtaining high-yield gentamicin strains.
【技术实现步骤摘要】
基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法
本专利技术属于微生物培养
,尤其是涉及一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法。
技术介绍
庆大霉素是由小单胞菌(绛红小单胞菌或棘孢小单胞菌)经发酵提取产生的一种氨基糖苷类抗生素,可以抑制细菌的蛋白质的生物合成,从而起到抑杀细菌的作用,对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有强效的杀菌作用。庆大霉素是主要的氨基糖苷类抗菌素,其市场占到氨基糖苷类抗菌素的50%。因此,开发针对庆大霉素工业生产菌株的高通量筛选诱变获取高产菌株,对实际应用有着重要意义。实际企业生产庆大霉素的绛红小单胞菌或棘孢小单胞菌株大多由传统的筛选方法获得,摇瓶培养,液相或生物法检测效价,存在投资高,筛选周期长,筛选通量小,筛选方法单一,筛选效率低下等缺点,因此庆大霉素的生产能力提高幅度较低。现有技术中并未形成整套的可以大规模高通量诱变筛选生产庆大霉素菌株的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法。本专利技术的方法可以帮助生产企业快速获取能够应用于实际生产的高产菌株。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现:一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法,包括以下步骤:第一步,孢子悬浮液制备:将成熟的工业生产菌株斜面上孢子或甘油管保藏的孢子接种于双碟培养基内,待孢子成熟后,取培养基上成熟的孢 ...
【技术保护点】
1.一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法,其特征在于,包括以下步骤:/n第一步,孢子悬浮液制备:将成熟的工业生产菌株斜面上孢子或甘油管保藏的孢子接种于双碟培养基内,待孢子成熟后,取培养基上成熟的孢子转移至装有无菌生理盐水的离心管中制备孢子悬浮液,根据孢子量稀释不同梯度;/n第二步,ARTP诱变复合诱变:将不同梯度的孢子悬浮液加入诱变剂后,使用ARTP诱变仪产生的等离子流处理不同时间进行诱变,诱变完成后立即涂布于双碟培养基内,待孢子成熟后,将待筛选的工业生产菌株单菌落分别接种于装有斜面培养基和发酵培养基的深孔板中培养;/n第三步,快速检测产物:微孔板发酵培养4-5天后对发酵液调节pH至1.4-1.5,常温放置后离心,取上清加入OPA衍生剂,加水,然后水浴,待冷至常温后放置于孔板离心机上离心,取上清液转移到酶标板上,然后设定酶标仪在325nm下测定各发酵液的吸光度,根据标准曲线计算对应产物含量获得高产菌株;/n第四步:初筛庆大霉素高产菌株和复筛获得高产菌株保藏:将快速筛选得到的菌株转接至深孔板斜面培养基上长出的对应的高产菌株同时接种于大试管斜面或茄子瓶斜面并进行摇 ...
【技术特征摘要】
1.一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法,其特征在于,包括以下步骤:
第一步,孢子悬浮液制备:将成熟的工业生产菌株斜面上孢子或甘油管保藏的孢子接种于双碟培养基内,待孢子成熟后,取培养基上成熟的孢子转移至装有无菌生理盐水的离心管中制备孢子悬浮液,根据孢子量稀释不同梯度;
第二步,ARTP诱变复合诱变:将不同梯度的孢子悬浮液加入诱变剂后,使用ARTP诱变仪产生的等离子流处理不同时间进行诱变,诱变完成后立即涂布于双碟培养基内,待孢子成熟后,将待筛选的工业生产菌株单菌落分别接种于装有斜面培养基和发酵培养基的深孔板中培养;
第三步,快速检测产物:微孔板发酵培养4-5天后对发酵液调节pH至1.4-1.5,常温放置后离心,取上清加入OPA衍生剂,加水,然后水浴,待冷至常温后放置于孔板离心机上离心,取上清液转移到酶标板上,然后设定酶标仪在325nm下测定各发酵液的吸光度,根据标准曲线计算对应产物含量获得高产菌株;
第四步:初筛庆大霉素高产菌株和复筛获得高产菌株保藏:将快速筛选得到的菌株转接至深孔板斜面培养基上长出的对应的高产菌株同时接种于大试管斜面或茄子瓶斜面并进行摇瓶发酵培养,发酵摇瓶培养结束后执行液相检测方法确定组分是否符合药典要求,如确认高产菌株则进行20-30%甘油管保藏菌种;
第五步,高产菌株稳定性考察:大试管斜面或茄子瓶斜面连续传代五次并进行发酵摇瓶培养测定庆大霉素产量和组分,确定经过初筛和复筛而获得高产菌的遗传稳定性。
2.根据权利要求1所述的一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法,其特征在于,第一步中,孢子悬浮液制备的浓度范围在2~5×109个孢子数量范围最佳,稀释梯度在10-4~10-6范围适合于ARTP诱变处理。
3.根据权利要求1所述的一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法,其特征在于,第二步中,使用ARTP诱变仪产生的等离子流处理不同时间的梯度为:10s、30s、60s、90s、120s共计5个梯度。
4.根据权利要求1所述的一种基于ARTP复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法,其特征在于,第二步中,使用ARTP诱变仪产生的等离子流处理不同时间进行诱变的条件为:等离子发射源与单孢子悬浮液的距离,气体流速,输出功率参数一定的条件下,通过改变诱变时间这唯一参数,进行诱变实验,诱变使用的工作气体为高纯氮,产生的等离子体温度控制在25℃到35℃之间。
5.根据权利要求1所述的一种基于ARTP复合诱变技术的高通...
【专利技术属性】
技术研发人员:李敏超,李兰,张嗣良,庄英萍,储炬,杭海峰,
申请(专利权)人:华东理工大学青岛创新研究院,华东理工大学,
类型:发明
国别省市:山东;37
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