一种细胞固定的方法技术

本发明专利技术提供了一种细胞固定的方法，包括：在将细胞重悬和过滤后，用0.5‑5体积％的甲醛溶液固定细胞的步骤。该方法可应用于单细胞测序的样本准备方法。该方法对前期细胞样本处理的要求并不严格，也无需特殊的仪器来处理细胞，并且成本低廉，操作简便。

A method of cell fixation

The invention provides a method of cell fixation, which comprises the steps of fixing cells with 0.5 \u2011 5 volume% formaldehyde solution after the cells are resuspended and filtered. This method can be applied to sample preparation for single cell sequencing. This method is not strict to the treatment of cell samples, and does not need special instruments to deal with cells, and it is cheap and easy to operate.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞固定的方法
本专利技术涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种细胞固定方法，该方法可应用于单细胞测序的样本准备方法。
技术介绍
传统的测序方法是在多细胞水平上进行的，由于多细胞生物细胞与细胞之间是存在差异的，所以传统的测序方式测出来的数据仅能代表所有细胞的平均状态，一些比较特异的细胞状态往往会被掩盖，所以普通测序的结果不可避免地会受到不同细胞间异质性(Heterogeneity)的影响。针对传统测序方式细胞异质性的问题，单细胞测序技术应运而生。单细胞测序(SingleCellSequencing)即利用优化后的高通量测序技术分析单个细胞的序列信息，从而更高分辨率地揭示细胞间的细胞差异以及其在微环境中的功能情况。目前，针对单细胞测序，主要有两个技术策略：第一种是，将单个细胞分离出来，然后独立构建文库进行测序。常用的细胞分离方法包括：显微分离法、口吸管技术、流式细胞分选法等，这些分离方法要么对操作者熟练程度要求较高，要么分离费用昂贵，而且通过分离单细胞再进行后续建库，由于通量小的问题造成额外高额的测序成本等都是很大的技术难题。为了克服这个困难，近年来多采用第二种策略：基于标签(barcode)的单细胞识别。它的主要思路是，给每一个细胞加上独一无二的标签，然后正常建库测序，在分析的时候，再把带有不同标签的测序信息进行分离。随着自动化平台如FluidigmC1,10xgenomics以及1cellbio系统的兴起，单细胞测序的通量有了很大的提高，但是在实验准备过程中，如何获得高品质的单细胞悬浮液，而且由于需要保证样本足够新鲜，测序公司不得不随时携带仪器上门服务，这些都是实验过程中新的技术挑战。现有的单细胞测序存在以下问题：1、单细胞分离需要借助相关的仪器；2、样本需要绝对新鲜，所以运输非常困难；3、基于10Xgenomics仪器，需要测序公司人员携仪器上门服务。
技术实现思路
本专利技术人发现，无论基于哪种技术策略，单细胞测序的难点都在于前期的样本处理。因此，本专利技术的一个目的是提供一种细胞固定方法，该方法完美地解决了上述技术难题。本专利技术利用液体甲醛对新鲜的细胞或者新鲜组织解离后的细胞悬液进行固定，经过固定的细胞样本可以在超低温冰箱(-80℃)中保存数月而不受影响。该方法对前期细胞样本处理的要求并不严格，也无需特殊的仪器来处理细胞，并且成本低廉，操作简便。本专利技术人经过反复试验证明，甲醛固定后的细胞依然能够保持RNA的完整性，并且固定后的细胞可以长期保存，不会对实验数据造成任何影响。本专利技术的另一目的是提供一种单细胞测序的方法，其包括用上述细胞固定方法固定细胞样本的步骤。根据一个方面，本专利技术提供了一种细胞固定方法，包括：用0.5-5体积％的甲醛溶液，优选1-2体积％的甲醛溶液，还更优选1.33体积％的甲醛溶液固定细胞的步骤。优选地，本专利技术的细胞固定方法还包括：在细胞固定后，对固定后的细胞进行离心、重悬和过滤的步骤。本专利技术的细胞固定方法中，所述重悬使用0℃～8℃预冷的含有RNase的缓冲液(优选PBS缓冲液)，更优选地，所述含有RNase的缓冲液为PBS-RI溶液(1xPBS+0.05U/μLRNase抑制剂)。本专利技术的细胞固定方法中，所述离心为：在500g，4℃离心3分钟。本专利技术的细胞固定方法中，所述细胞意指本领域中已知的任何细胞，其不受任何具体类型的限制，例如，可以包括PBMC、Hela、NIH/3T3、HEK293等。本专利技术的细胞固定方法中，优选地，所述细胞可以是新鲜的细胞或者来自新鲜组织解离后的细胞悬液。本专利技术的细胞固定方法中，优选地，使用甲醛溶液的固定时间可以为5-20分钟，优选10分钟。本专利技术的细胞固定方法，包括以下步骤：1)将细胞处理成细胞悬液后，进行离心处理，得到细胞沉淀；2)向步骤1)中得到的细胞沉淀中，加入0℃～8℃预冷的含有RNase的缓冲液(优选PBS缓冲液)重悬，并过滤，得到细胞悬液；3)向步骤2)中得到的细胞悬液中加入0℃～8℃预冷的0.5-5体积％的甲醛溶液，优选1-2体积％的甲醛溶液，还更优选1.33体积％的甲醛溶液，以固定细胞；4)向步骤3)中得到的固定细胞中加入TritonX-100溶液(例如，用1XPBS作为溶剂配制的5％TritonX-100溶液)，静置孵育细胞；其中，优选地，加入的Triton-X100的终浓度为0.05％～0.5％(体积分数)；5)将步骤4)中得到的细胞进行离心处理，得到细胞沉淀；6)向步骤5)中得到的细胞沉淀中加入0℃～8℃预冷的含有RNase的缓冲液(优选PBS缓冲液)，重悬细胞；7)向步骤6)中得到的重悬细胞中加入0℃～8℃预冷的Tris-HCL溶液(例如，用1XPBS作为溶剂配制为100mMpH＝8)，混匀；其中，优选地，加入的Tris-HCl的终浓度优选为20mM～50mM；8)向步骤7)中得到的混匀的细胞溶液中加入Triton-X100溶液(例如，用1XPBS作为溶剂配制为5％Triton-X100溶液)，混匀；其中，优选地，加入的Triton-X100的终浓度为0.05％～0.5％(体积分数)；9)将步骤8)中得到的混匀的细胞溶液进行离心处理，得到细胞沉淀；10)向步骤9)中得到的细胞沉淀中加入0℃～8℃预冷的0.5X含有RNase的缓冲液(优选PBS缓冲液)，使细胞重悬；11)将步骤10)中重悬的细胞过滤得到细胞悬液。优选地，本专利技术的细胞固定方法还包括12)将步骤11)中得到的细胞悬液进行稀释的步骤。本专利技术中，可以将步骤12)稀释后细胞放在离心管中保存在-80℃冰箱。本专利技术方法步骤1)中，优选地，所述离心为：在500g，4℃离心3分钟。本专利技术方法步骤2)、步骤6)和/或步骤9)中，优选地，所述含有RNase的缓冲液为PBS-RI溶液(1xPBS+0.05U/μLRNase抑制剂)。本专利技术方法步骤2)中，优选地，向步骤1)中得到的细胞沉淀中，加入0℃～8℃预冷的PBS-RI溶液，并使细胞重悬；以及将重悬的细胞通过细胞筛过滤，得到细胞悬液。本专利技术方法步骤3)中，优选地，所述细胞悬液与所述甲醛溶液的体积比为大于1:10，优选为1:3。根据试剂的实际所用体系决定上限，每个样本的上限为50mL甲醛溶液。本专利技术方法步骤3)中，优选地，所述甲醛溶液为用细胞处理过程中使用的缓冲液配制的，更优选地，所述甲醛溶液为用1XPBS缓冲液配制的。所述体积％指的是甲醛与缓冲液的体积比。本专利技术方法步骤3)中，优选地，使用甲醛溶液的固定时间可以为5-20分钟，优选10分钟。本专利技术方法步骤4)中，优选地，静置孵育细胞3分钟。本专利技术方法步骤5)中，优选地，所述离心为：在500g，4℃离心3分钟。本专利技术方法步骤9)中，优选地，所述离心为：在500g，4℃离心3分钟。本专利技术方法步骤11)中，优选地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞固定方法，包括：用0.5-5体积％的甲醛溶液，优选1-2体积％的甲醛溶液，还更优选1.33体积％的甲醛溶液固定细胞的步骤。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞固定方法，包括：用0.5-5体积％的甲醛溶液，优选1-2体积％的甲醛溶液，还更优选1.33体积％的甲醛溶液固定细胞的步骤。


2.根据权利要求1所述的细胞固定方法，还包括：在细胞固定后，对固定后的细胞进行离心、重悬和过滤的步骤。


3.根据权利要求1所述的细胞固定方法，包括以下步骤：
1)将细胞处理成细胞悬液后，进行离心处理，得到细胞沉淀；
2)向步骤1)中得到的细胞沉淀中，加入0℃～8℃预冷的含有RNase的缓冲液(优选PBS缓冲液)重悬，并过滤，得到细胞悬液；
3)向步骤2)中得到的细胞悬液中加入0℃～8℃预冷的0.5-5体积％的甲醛溶液，优选1-2体积％的甲醛溶液，还更优选1.33体积％的甲醛溶液，以固定细胞；
4)向步骤3)中得到的固定细胞中加入Triton-X100溶液，静置孵育细胞；
5)将步骤4)中得到的细胞进行离心处理，得到细胞沉淀；
6)向步骤5)中得到的细胞沉淀中加入0℃～8℃预冷的含有RNase的缓冲液(优选PBS缓冲液)，重悬细胞；
7)向步骤6)中得到的重悬细胞中加入0℃～8℃预冷的Tris-HCL溶液，混匀；
8)向步骤7)中得到的混匀的细胞溶液中加入Triton-X100溶液，混匀；
9)将步骤8)中得到的混匀的细胞溶液进行离心处理，得到细胞沉淀；
10)向步骤9)中得到的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李奇，孔培涛，陈亚庆，杨圳，蔡建飞，
申请(专利权)人：上海其明信息技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31