一种金属有机框架-腈水合酶复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种金属有机框架‑腈水合酶复合物及其制备方法和应用，属于生物催化技术领域。所述制备方法包括：将六水合硝酸钴溶于钴依赖型腈水合酶溶液中，再与2‑甲基咪唑水溶液混合，反应制得所述金属有机框架‑腈水合酶复合物。利用钴基金属有机框架材料为载体，与钴依赖型腈水合酶具有较高的生物亲和力，在水相中一锅法包埋腈水合酶制备复合纳米酶，保证其生物催化活力。该复合纳米酶具有形态稳定、孔隙率高、负载率大等优点，保证底物和产物分子的自由扩散。同时，该复合纳米酶具有较高的热稳定性，在催化合成烟酰胺过程中，表现出良好的重复利用率、较高的时空生产效率，有望成为生物催化领域中的一类良好生物催化剂。

A metal organic framework nitrile hydratase complex and its preparation and Application

The invention discloses a metal organic framework nitrile hydratase complex and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of biocatalysis. The preparation method comprises the following steps: dissolving cobalt nitrate hexahydrate in cobalt dependent nitrile hydratase solution, mixing it with 2 \u2011 methylimidazole aqueous solution, and preparing the metal organic framework nitrile hydratase complex. Using cobalt based metal organic framework material as the carrier, it has a high biological affinity with cobalt dependent nitrile hydratase. In the water phase, one pot method is used to embed nitrile hydratase to prepare composite nano enzyme to ensure its biological catalytic activity. The composite enzyme has the advantages of stable morphology, high porosity and high loading rate, which ensures the free diffusion of substrate and product molecules. At the same time, the composite enzyme has high thermal stability. In the process of catalytic synthesis of nicotinamide, it shows good reuse rate and high space-time production efficiency, and is expected to become a kind of good biocatalyst in the field of biocatalysis.

【技术实现步骤摘要】
一种金属有机框架-腈水合酶复合物及其制备方法和应用
本专利技术属于生物催化领域，具体涉及采用生物矿化策略构建一种金属有机框架-腈水合酶复合纳米酶及其在催化合成烟酰胺中的应用。
技术介绍
酶是一种催化效率高、专一性强(包括底物特异性，立体异构特异性和化学特异性)的生物催化剂。但是由于酶的蛋白质特征，凡是能够引起蛋白质变性的因素都可能会造成酶的失活，如pH、重金属盐、热、紫外线、剧烈震荡等。即使在最适的催化条件下，随着反应时间的延长，酶催化反应速度也会逐渐下降。另外，游离酶在催化反应后难以回收，给产物分离和提纯工艺造成困难，导致生产成本提高。这些因素都极大地限制了生物酶催化剂在现代工业中的应用。腈水合酶(Nitrilehydratase,EC4.2.1.84)催化腈类化合物(-CN)生成相应的酰胺(CONH2)，被应用于丙烯酰胺、烟酰胺和5-氰基戊酰胺等化学品的工业催化生产中。如PeiX.等克隆来源于锰氧化澄单胞菌SI859A(AurantimonasmanganoxydansSI859A)腈水合酶催化3-氰基吡啶制备烟酰胺，该腈水合酶表现出较好的热稳定性，在30和40℃条件下的半衰期分别为48和18h(JournalofBiochemistry,48:1921-1927,2013)。PrasadS.等从土壤筛选到一株紫红红球菌PA-34(RhodococcusrhodochrousPA-34)用于催化3-氰基吡啶的水合反应，在1L的反应体系中，含9.0g野生菌细胞(干重)，12h内完全转化7M3-氰基吡啶水合生成855g烟酰胺，其时空生产效率为71.2g烟酰胺/L/h(IndianJournalofMicrobiology,47:34-41,2007)。然而，腈水合酶的稳定性普遍较差，同时由于其催化的水合反应属于放热反应，直接导致酶活力的丧失。因此，如何提高腈水合酶的热稳定性是该领域的研究热点之一。酶的固定化技术可有效地束缚酶的构象，是稳定酶活性的重要方法，同时可以实现生产连续化，降低工业生产成本，同时在节能、环保等方面显示出巨大的潜在应用价值，为酶的应用提供了广阔的前景。在众多酶固定化的材料中，金属有机框架(Metal-organicframework，MOF)具有形貌多样性、孔径尺寸的可调性、以及优良的比表面积等优点，已逐渐应用于生物酶的的固定化中。目前，采用MOF固定酶蛋白主要由三种方法，分别是表面吸附、共价连接和孔道装载。但是，这些方法都分别存在各自的缺陷，如表面物理吸附方式，酶蛋白容易发生脱落；而共价连接方式通常需要交联剂，导致酶蛋白活力的损失；孔道装载需要复杂的有机配体作为联接桥，导致固定化成本较高。与上述固定化策略比较，生物矿化技术是近年来发展的一类新型酶固定化策略，模拟软体动物外壳、哺乳动物牙床和骨骼等形成过程，实现生物大分子的原位组装，形成具有生物活性的复合纳米颗粒，表现出良好的稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于采用生物矿化技术制备钴基金属有机框架材料ZIF-67，实现腈水合酶的原位固定，以提升腈水合酶的热稳定性。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种金属有机框架-腈水合酶复合物的制备方法，包括：将六水合硝酸钴溶于钴依赖型腈水合酶溶液中，再与2-甲基咪唑水溶液混合，反应制得所述金属有机框架-腈水合酶复合物。本专利技术以二价钴离子作为MOF结构的结点，与钴依赖型腈水合酶具有较高的生物亲和力，保证其生物催化活力。另外，利用二价钴离子与2-甲基咪唑配位形成MOF结构时将游离酶包埋进来，模拟生物矿化过程，克服传统工艺对酶蛋白的破环，酶活力回收率高，同时实现纳米酶与反应液的快速分离，提高烟酰胺的时空产率。本专利技术在水相体系中，通过优化硝酸钴与2-甲基咪唑的摩尔比，形成的金属有机框架-腈水合酶复合物具有形态稳定、孔隙率高、负载率大等优点，保证底物和产物分子的自由扩散。同时，复合纳米酶的合成工艺采用纯水相体系，避免传统工艺中甲醇、乙醇等有机溶剂的使用，反应条件温和，对环境相对友好。作为优选，反应体系中，钴依赖型腈水合酶的浓度为0.25～0.6mg/mL，六水合硝酸钴的浓度为0.006～0.013mol/L，2-甲基咪唑的浓度为0.12～0.57mol/L。反应体系中，硝酸钴与2-甲基咪唑摩尔比为1:20～1:40。研究表明，二价钴离子与2-甲基咪唑的摩尔比≥30时，所制备的MOF材料ZIF-67表现出均一的立体外貌。作为优选，所述反应的条件为：在20～30℃条件下搅拌反应1～2h，再于4～10℃条件下，静置反应10～12h。反应结束后，在6000～8000r/min离心5～10min，收集紫色沉淀，经蒸馏水洗涤2～3次，再经真空冷冻干燥后得到紫色粉末，即为金属有机框架-腈水合酶复合物。本专利技术提供了由所述的制备方法制得的金属有机框架-腈水合酶复合物，该复合物为以二价钴离子为结点，通过配位结合2-甲基咪唑形成空腔时，原位将腈水合酶包埋形成的复合纳米酶，复合物颗粒大小为200～400nm。本专利技术还提供了所述的金属有机框架-腈水合酶复合物在催化3-氰基吡啶合成烟酰胺中的应用。所述应用包括：以pH为8.0～9.0的磷酸缓冲液为反应介质，以所述金属有机框架-腈水合酶复合物为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，在20～30℃条件下进行反应，制得所述烟酰胺。作为优选，反应体系中，底物的浓度为0.5～0.9mol/L，催化剂的用量为15～25g/L。腈水合酶是微生物降解腈化合物的双酶途径中的关键酶，除了催化生成高附加值的酰胺化合物外，可以应用于有机腈污废水的处理中。本专利技术具备的有益效果：本专利技术采用生物矿化策略制备金属有机框架-腈水合酶复合物，利用钴基金属有机框架材料为载体，与钴依赖型腈水合酶具有较高的生物亲和力，在水相中一锅法包埋腈水合酶制备复合纳米酶，保证其生物催化活力。该复合纳米酶具有形态稳定、孔隙率高、负载能力强、以及较低的底物产物扩散阻力等优点，具有良好的生物亲和性、较高的活力回收率、以及较高的热稳定性，所制备的纳米酶的负载率为39.9mg/gZIF-67，比活力达到29.5U/mg，在30℃和40℃条件下的半衰期分别为102.0h和26.5h。本专利技术所制备的金属有机框架-腈水合酶复合物可以高效催化3-氰基吡啶生产烟酰胺，具有良好的分批重复利用率，时空生产效率高，达到110g/h/L。因此，本专利技术提供的金属框架-腈水合酶复合纳米酶具有高催化活力和高热稳定性，有望成为生物催化和生物修复领域中的一类良好生物催化剂。附图说明图1为腈水合酶基因工程菌诱导表达蛋白SDS-PAGE电泳图，其中M：低分子量标准蛋白质；W：基因工程菌诱导后菌体破碎液；S：基因工程菌诱导菌体破碎上清液；I：基因工程菌诱导菌体破胞沉淀；箭头指示腈水合酶的位置。图2为实施例2制备的金属有机框架MOF材料ZIF-67的扫描电镜图，其中A为硝酸钴与二甲基咪唑摩尔比为1:30，B本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金属有机框架-腈水合酶复合物的制备方法，其特征在于，包括：将六水合硝酸钴溶于钴依赖型腈水合酶溶液中，再与2-甲基咪唑水溶液混合，反应制得所述金属有机框架-腈水合酶复合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种金属有机框架-腈水合酶复合物的制备方法，其特征在于，包括：将六水合硝酸钴溶于钴依赖型腈水合酶溶液中，再与2-甲基咪唑水溶液混合，反应制得所述金属有机框架-腈水合酶复合物。


2.如权利要求1所述的金属有机框架-腈水合酶复合物的制备方法，其特征在于，反应体系中，钴依赖型腈水合酶的浓度为0.25～0.6mg/mL，六水合硝酸钴的浓度为0.006～0.013mol/L，2-甲基咪唑的浓度为0.12～0.57mol/L。


3.如权利要求1所述的金属有机框架-腈水合酶复合物的制备方法，其特征在于，反应体系中，硝酸钴与2-甲基咪唑摩尔比为1:20～1:40。


4.如权利要求1所述的金属有机框架-腈水合酶复合物的制备方法，其特征在于，所述反应的条件为：在20～30℃条件下搅拌反应1～2h，再于4～10℃条件下，静置反应10～12h。


5.如权利要求1所述的金属有机框架-腈水合酶复合物的制备方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴晓林，吴益锋，王加跑，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33