一种基于酵母双杂交技术高效筛选膜蛋白互作蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于酵母双杂交技术筛选膜蛋白互作蛋白的方法，通过采诱饵蛋白载体的选择、进行自激活检测及诱饵载体功能验证、进行膜体系双杂交文库筛选酵母、质粒提取、酵母质粒的扩繁等步骤，优化了诱饵载体的选择，筛选合适的诱饵载体，可以最大限度的筛选到更多的互作蛋白；优化了酵母感受态细胞的制备过程，通过一种接近于定量的方法较好得把握了摇菌的过程，可以使酵母感受态细胞的状态达到最优，比较有利于文库的表达，可以较好地把握实验进度，提高了实验稳定性；基于泛素系统的膜蛋白互作最后的PCR验证，极大促进了膜蛋白互作研究方法的高效性和稳定性，为科研工作者提供了先进的技术手段和理论基础。

An efficient method for screening membrane protein interacting proteins based on yeast two hybrid technology

The invention relates to a method for screening membrane protein interacting protein based on yeast two hybrid technology, which optimizes the selection of bait carrier, selects suitable bait carrier through the steps of bait carrier selection, self activation detection, bait carrier function verification, membrane system two hybrid library screening yeast, Plasmid Extraction, yeast plasmid propagation, etc., and can limit the maximum More interacting proteins were screened out; the preparation process of yeast receptive cells was optimized; the shaking process was well grasped by a method close to quantitative method, which could optimize the state of yeast receptive cells, facilitate the expression of library, grasp the progress of experiment and improve the stability of experiment; the membrane protein interaction based on ubiquitin system was the best After the PCR verification, it greatly promoted the efficiency and stability of the membrane protein interaction research method, and provided advanced technical means and theoretical basis for researchers.

【技术实现步骤摘要】
一种基于酵母双杂交技术高效筛选膜蛋白互作蛋白的方法
本专利技术涉及生物分子学领域，具体涉及一种利用酵母双杂交高效筛选膜蛋白互作蛋白的方法。
技术介绍
酵母双杂交是分析蛋白互作快速且高效的方法。根据检测原理与对象的不同，酵母双杂交系统可分为GAL4(酵母转录激活蛋白GAL4的基因)系统和泛素系统两大类。GAL4系统是研究细胞核蛋白的互作，而基于泛素系统的酵母双杂交技术则可以特异地研究膜蛋白的互作，为膜蛋白研究工作者提供了体内互作的新型技术手段。此外，构建膜蛋白捕获文库，利用诱饵膜蛋白进行互作实验，可以从文库中高效筛选与膜蛋白相互作的目的蛋白。此技术对专利技术，不仅为膜蛋白研究工作者筛选新蛋白和课题创新提供技术手段，且为膜蛋白信号转导、生物学功能及生物发育等热点问题提供理论和技术支持。DUALmembrane系统(DUALmembranesystem)是以分离的泛素(split-ubiquitin)为基础，它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法，为分析膜蛋白间的互作提供可能。其主要特点是可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究。泛素是一种含76个氨基酸的保守蛋白，其常与其他蛋白质的N端相连接并起始降解信号。泛素能被其特异性的蛋白酶(ubiquitin-specificproteases,UBPs)识别并对泛素蛋白C端切割位点进行切割。在基于泛素系统的膜蛋白互作鉴定体系中，泛素蛋白可分成两部分表达：包括N端部分(NubI,第1～34位氨基酸)和C端部分(Cub,第35～76位氨基酸)，后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白转录因子。因此NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白体系。野生型NubI与Cub具有高亲和力并能自发形成异源二聚体。将NubI的第13位异亮氨酸用丙氨酸或甘氨酸替换，突变后的NubG与Cub之间的亲和力大幅降低。因此，改造过的NubG与Cub-LexA之间只能依靠与其融合的两个目的蛋白相互作用而连接。当位于细胞膜上的两个蛋白发生相互作用时，与其相连的C端的泛素蛋白(Cub)和N端的泛素蛋白(NubG)因距离靠近而形成一个完整的泛素蛋白分子，诱导UBPs识别并对其C端进行剪切，从而释放出转录因子LexA，最终启动核报告基因的转录。基于上述原理，研究人员可通过检测转录因子LexA的切割便可获得2个蛋白之间的互作关系。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于酵母双杂交互作的高效膜蛋白互作蛋白筛选方法，可以有效的研究膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作。本专利技术所提供的酵母双杂交方法筛选膜蛋白互作蛋白的方法，包括以下步骤：步骤一、诱饵蛋白载体的选择。根据蛋白N和C端在细胞质膜或细胞器膜与胞质的分布情况以及蛋白N端是否存在信号肽来判断具体载体的选择，选择标准见表1和图3所示。分析蛋白N端和C端的定位的数据库主要是通过该蛋白的亚细胞定位、有无跨膜域以及该蛋白的三维结构等，分析跨膜域的网站主要是http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/#opennewwindow。首先输入该蛋白的氨基酸序列，单击submit按钮，得到结果，根据WEBSEQUENCENumberofpredictedTMHs后的结果是0或1来判断该蛋白是否具有跨膜域以及跨膜域的位置，如果有跨膜域，说明该蛋白定位于细胞膜或者细胞器膜，另外可以结合和它相似物种的同源基因的亚细胞定位。分析该蛋白的三维结构的数据库主要有PDB、SWISS-PROT数据库等。分析信号肽主要从网络数据库中预测和鉴定：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/(SignalP4.0)。首先上传序列，点击submit按钮，得到结果，由SignalPeptide？是Yes或者No可知待测蛋白是否存在信号肽。分析完成后根据表1选择合适的诱饵载体进行构建，最大限度得保证该蛋白成功使用该体系进行筛选。诱饵载体构建具体选择标准参考表1所示，当诱饵蛋白N端的定位在细胞外或胞腔内，且诱饵蛋白N端含信号肽，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-SUC；当诱饵蛋白N端的定位在细胞外或胞腔内，且诱饵蛋白N端无信号肽，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-STE；当诱饵蛋白N端的定位在细胞质，诱饵蛋白C端的定位在细胞外或胞腔内时，选择的载体为pBT3-N；当诱饵蛋白N端的定位在细胞质，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-N或pBT3-STE。表1：三种诱饵载体选择标准步骤二、自激活检测及诱饵载体功能验证：以质粒pTSU2-APP和pPR3-N为阴性对照，质粒pTSU2-APP和pNubG-Fe65为阳性对照。阴阳对照的实验结果，可以较好的辅助自激活检测和诱饵载体功能验证的实验结果。自激活检测及诱饵载体功能验证的步骤大体上可以分为NMY51感受态的制备与质粒的转化两部分，具体实验步骤如下：1)将NMY51酵母菌种划线于YPDA平板，30℃倒置培养2天左右；2)用枪头挑取若干酵母单克隆于50ml的YPDA培养基中，30℃摇床220–250rpm振荡培养12小时；3)振荡培养后，取两毫升菌液2000rpm离心五分钟，弃掉培养基，用ddH2O重悬。以ddH2O为对照，测定菌液在OD600吸收峰值达到0.4–0.8之间即可；4)将培养12小时的菌液倒入50mL的离心管中，5000rpm离心5分钟，弃上清，加入2.5mLddH2O重悬菌体；5)2000rpm离心五分钟，收集菌体，加入250uL1MLiAc,250uL10×TE，2mLddH2O，即获得25支感受态，用1.5mL离心管分装每管100uL，置于冰上待用；6)变性鲑鱼精DNA(ssDNA)准备工作：从-20℃冰箱中拿出ssDNA，放在沸水浴中煮沸5min，然后迅速置于冰上冷却2分钟，重复上述操作一次；7)按照表2构建四种质粒组合，将质粒组合加入感受态中，再分别依次加入10uL的ssDNA，600uL的PEG/LiAcmix，涡旋震荡混匀；表2显示的自激活与诱饵载体的检测组合方法为：进行四组反应组合实验，反应组合一为1.5μg的Bait载体与1.5μg的pOst1-NubI，反应组合二为1.5μg的Bait载体与1.5μg的pPR3-N，反应组合三为1.5μg的pTSU2-APP与1.5μg的pNubG-Fe65，反应组合四为1.5μg的pTSU2-APP与1.5μg的pPR3-N。表2自激活与诱饵载体的检测组合反应组合质粒(1.5μg)质粒(1.5μg)1Bait载体pOst1-NubI2Bait载体pPR3-N3pTSU2-APPpNubG-Fe654pTSU2-APPpPR3-N8)3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于酵母双杂交技术筛选膜蛋白互作蛋白的方法，该方法包括以下步骤：/n步骤1、诱饵蛋白载体的选择：根据蛋白N端和C端在细胞质膜与胞质的定位以及蛋白N端是否存在信号肽来判断载体的选择，具体选择标准为当诱饵蛋白N端的定位在细胞外或胞腔内，且诱饵蛋白N端含信号肽，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-SUC；当诱饵蛋白N端的定位在细胞外或胞腔内，且诱饵蛋白N端无信号肽，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-STE；当诱饵蛋白N端的定位在细胞质，诱饵蛋白C端的定位在细胞外或胞腔内时，选择的载体为pBT3-N；当诱饵蛋白N端的定位在细胞质，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-N或pBT3-STE；/n步骤二、进行自激活检测及诱饵载体功能验证：以质粒pTSU2-APP和pPR3-N为阴性对照，质粒pTSU2-APP和pNubG-Fe65为阳性对照，进行阴阳对照，分析实验结果；/n步骤三、进行膜体系双杂交文库筛选，挑取酵母菌落，采用高温煮沸和液氮冷却的方法破除酵母细胞壁，具体的操作步骤为：挑取四缺板上成功生长的酵母阳性单菌落，加入10uL0.9％NaCl重悬起单菌落，将离心管放在沸水中煮沸5min，液氮冷却2min，如此重复一次，加入pPR3-N质粒的通用引物以及PCR MIX缓冲液进行菌落PCR验证，对于PCR验证没有条带的菌落抽提质粒进行测序；/n步骤四、酵母质粒提取；/n步骤五、酵母质粒的扩繁。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于酵母双杂交技术筛选膜蛋白互作蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1、诱饵蛋白载体的选择：根据蛋白N端和C端在细胞质膜与胞质的定位以及蛋白N端是否存在信号肽来判断载体的选择，具体选择标准为当诱饵蛋白N端的定位在细胞外或胞腔内，且诱饵蛋白N端含信号肽，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-SUC；当诱饵蛋白N端的定位在细胞外或胞腔内，且诱饵蛋白N端无信号肽，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-STE；当诱饵蛋白N端的定位在细胞质，诱饵蛋白C端的定位在细胞外或胞腔内时，选择的载体为pBT3-N；当诱饵蛋白N端的定位在细胞质，诱饵蛋白C端的定位在细胞质时，选择的载体为pBT3-N或pBT3-STE；
步骤二、进行自激活检测及诱饵载体功能验证：以质粒pTSU2-APP和pPR3-N为阴性对照，质粒pTSU2-APP和pNubG-Fe65为阳性对照，进行阴阳对照，分析实验结果；
步骤三、进行膜体系双杂交文库筛选，挑取酵母菌落，采用高温煮沸和液氮冷却的方法破除酵母细胞壁，具体的操作步骤为：挑取四缺板上成功生长的酵母阳性单菌落，加入10uL0.9％NaCl重悬起单菌落，将离心管放在沸水中煮沸5min，液氮冷却2min，如此重复一次，加入pPR3-N质粒的通用引物以及PCRMIX缓冲液进行菌落PCR验证，对于PCR验证没有条带的菌落抽提质粒进行测序；
步骤四、酵母质粒提取；
步骤五、酵母质粒的扩繁。


2.一种如权利要求1所述的基于酵母双杂交技术筛选膜蛋白互作蛋白的方法，其特征在于，步骤一中诱载体具体为：
pBT3-N上游的序列如SEQUENCEID.NO.3所示，下游的序列如SEQUENCEID.NO.4所示；
pBT3-SUC上游的序列如SEQUENCEID.NO.5所示，下游的序列如SEQUENCEID.NO.6所示；
pBT3-STE上游的序列如SEQUENCEID.NO.7所示，下游的序列如SEQUENCEID.NO.8所示。


3.一种如权利要求1所述的基于酵母双杂交技术筛选膜蛋白互作蛋白的方法，其特征在于，步骤二中自激活检测及诱饵载体功能验证的具体步骤包括：
1)制备酵母感受态细胞；
2)准备变性的ssDNA；
3)构建四种质粒组合，分别为：组合一为1.5μg的质粒Bait与1.5μg的质粒pOst1-NubI，反应组合二为1.5μg的质粒Bait与1.5μg的质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：林金星，郑文清，张曦，冯圣年，王树芳，祝蕾，毋瑞华，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11