DNA二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种DNA二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒。其中，该构建方法包括以下步骤：将DNA样本通过酶切的方法获得片段化的原始模版DNA，然后无需纯化酶切反应液，直接将酶切产物进行基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库。应用本发明专利技术的技术方案，基于酶切进行片段化并联用单链建库的方法来构建FFPE样本NGS测序文库，简单阐述为：使用酶切的方法对FFPE DNA进行片段化，之后无需对反应产物进行纯化，直接利用单链建库方法构建测序文库，该方法能够对低起始量、样本降解严重的FFPE样本进行建库，提高建库成功率以及原始模版检出数量。

DNA second generation sequencing library and its construction method, construction kit

The invention discloses a DNA second generation sequencing library, a construction method and a construction kit. Among them, the construction method includes the following steps: the original template DNA is obtained by the method of enzyme cutting, and then the second-generation DNA sequencing library is constructed by the method of single strand junction based on the products of enzyme cutting without purification of enzyme cutting reaction solution. The technical scheme of the invention is applied to construct the FFS sequencing Library of FFPE samples based on the method of sectioning and parallel connection of enzyme cutting, which is simply described as follows: the FFPE DNA is segmented by the method of enzyme cutting, and then the reaction product is not required to be purified, and the sequencing library is directly constructed by the method of single chain building, which can be used for FFPE samples with low initial amount and serious sample degradation The database is built to improve the success rate of database building and the number of original template checkout.

【技术实现步骤摘要】
DNA二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种DNA二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒。
技术介绍
FFPE(formalin-fixedparaffinembedded，福尔马林固定和石蜡包埋)样本存在样本量低，样本中DNA降解严重等特点，这些特点使得FFPE样本极易建库失败。在常规的双链建库中，损伤的DNA在接头连接后进行PCR扩增的过程中会丢失，从而使得大量模版丢失。而单链建库首先将双链DNA进行变性形成单链，在这个过程中损伤DNA也可以形成片段化的单链DNA，然后进行单链接头的连接，进而最大程度的减少原始模版的损失。目前的文库构建，由于测序仪器的读长限制，需要文库的插入片段长度有一定的限制，这就要求对原始模版进行片段化。目前片段化的方法主要有两种：一种是利用超声打断的方式获得片段化的DNA，一种是利用酶切的方法对DNA进行切割。这两种方法都是对DNA进行处理，处理后都需要进行纯化。而任何纯化/操作都将损失部分原始DNA。KAPA公司有一款基于酶切的方法进行文库构建的试剂盒，该试剂盒可以对DNA进行酶切，并无需对酶切产物进行纯化，之后直接进行双链建库。该方法在一定程度上减少原始模版片段化的损失，但是无法避免损伤的DNA分子在建库中的丢失。目前常用的测序文库构建方法均是双链建库。另外基于插入片段的打断方法，原始模版在片段化后都需要进行纯化以获得所需的目的片段大小的DNA，这一过程会损失一定量的DNA，对于FFPE样本，DNA模版损失越多，建库失败概率越大。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种DNA二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒，以解决现有技术中降解严重FFPE样本建库极易因DNA数量低而失败的技术问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种DNA二代测序文库的构建方法。该构建方法包括以下步骤：将DNA样本通过酶切的方法获得片段化的原始模版DNA，然后无需纯化酶切反应液，直接将酶切产物进行基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库。进一步地，DNA样本为FFPE样本提取的DNA。进一步地，基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库为swift单链建库方法。进一步地，swift单链建库方法包括模版变性、单链接头连接、延伸及产物纯化、二链接头连接及产物纯化和indexPCR扩增及产物纯化。根据本专利技术的另一方面，提供了一种DNA二代测序文库。该DNA二代测序文库通过上述任一种DNA二代测序文库的构建方法构建得到。根据本专利技术的再一方面，提供了一种DNA二代测序文库的构建试剂盒。该构建试剂盒包括酶切相关的试剂和基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库的试剂。应用本专利技术的技术方案，基于酶切进行片段化并联用单链建库的方法来构建FFPE样本NGS测序文库，简单阐述为：使用酶切的方法对FFPEDNA进行片段化，之后无需对反应产物进行纯化，直接利用单链建库方法构建测序文库，该方法能够对低起始量、样本降解严重的FFPE样本进行建库，提高建库成功率以及原始模版检出数量。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1示出了根据本专利技术一实施方式的DNA二代测序文库构建方法的流程示意图；以及图2示出了实施例1的C级两个FFPE样本不同方法的结果比较示意图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。针对现有技术中降解严重FFPE样本建库极易因DNA数量低而失败的技术问题，本申请提出了下列技术方案。根据本专利技术一种典型的实施方式，提供了一种DNA二代测序文库的构建方法。该方法包括以下步骤：将DNA样本通过酶切的方法获得片段化的原始模版DNA，然后无需纯化酶切反应液，直接将酶切产物进行基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库。本专利技术联用酶切片段化DNA的方法和单链建库的方法，最大程度的保护原始DNA模版，使得低起始量以及降解严重的FFPE样本能够有更高的建库成功率以及更高的原始模版检出率。典型的，本专利技术用于NGS测序文库构建的主要步骤如下：1)对FFPEDNA进行酶切片段化；2)单链文库构建。其中，典型的，基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库为swift单链建库方法。swift单链建库方法包括模版变性、单链接头连接、延伸及产物纯化、二链接头连接及产物纯化和indexPCR扩增及产物纯化。当然，此步骤也可以通过其他类似的方法实现。在本申请中，各试剂可采用本领域的商业化试剂，例如，酶切可以使用KAPAFragkit中的酶进行反应，获得片段化的DNA。对酶切后的反应体系不进行纯化，避免片段化的DNA模版损失，直接进行后续的建库。建库方法中对模版DNA进行变性，获得单链DNA并进行单链接头连接等步骤，最后构建可用于常规测序的双链文库。在本专利技术一种典型的实施方式中，具体步骤详见图1：DNA片段化(酶切方法打断DNA)、终止酶切反应、swift单链建库以及panel捕获(注：1、虚线所示部分为本实验优化的步骤，表示不进行反应液的纯化，直接进行后续实验步骤。2、panel捕获为验证NGS测序文库建库效果而进行的)，其中，swift单链建库主要包括：模版变性、单链接头连接、延伸及产物纯化、二链接头连接及产物纯化和indexPCR扩增及产物纯化。本方法结合了酶切片段化DNA及单链建库的文库构建方法，提供了一种可供选择的建库流程，能够对FFPE样本进行文库构建并获得更高的建库成功率及更高的原始模版检出率。根据本专利技术一种典型的实施方式，提供一种DNA二代测序文库。该DNA二代测序文库通过上述DNA二代测序文库的构建方法构建得到。根据本专利技术一种典型的实施方式，一种DNA二代测序文库的构建试剂盒。该试剂盒包括酶切相关的试剂和基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库的的试剂。下面将结合实施例进一步说明本专利技术的有益效果。实施例1在本实施例中，主要工作分为两部分，即第一部分实验部分和第二部分数据分析部分。在第一部分中，待检的样本是FFPE判定为C级的样本(等级判定方法如下：A级，有主带或降解均匀且降解区域主要集中在5000bp以上；B级，无主带，降解均匀且降解区域主要集中在1500-5000bp之间；C级，无主带，降解均匀且降解区域主要集中在500-1500bp之间；D级，无主带，降解区域弥散在250-1000bp或集中在500bp以下)。在本实施例中，主要试剂用品是市售的，信息如下表1所示：表1操作步骤如下：一：DNA片段化(参考KAPAFragkit说明书)1.片段化处理25ng样本使用0.5×反应体系，10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将DNA样本通过酶切的方法获得片段化的原始模版DNA，然后无需纯化酶切反应液，直接将酶切产物进行基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将DNA样本通过酶切的方法获得片段化的原始模版DNA，然后无需纯化酶切反应液，直接将酶切产物进行基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述DNA样本为FFPE样本提取的DNA。


3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库为swift单链建库方法。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘杨杨，李瑞强，李雷，姚文钧，宋迎楠，成岗，
申请(专利权)人：北京诺禾致源科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11