突变型2-脱氧-青蟹肌糖合酶制造技术

多肽，其在序列号1的氨基酸序列或其相似序列中、于序列号1的氨基酸序列的N末端起第14位、第37位、第290位、第293位及第319位的氨基酸残基中至少一者处具有特定的氨基酸突变；多核苷酸，其具有编码所述多肽所具有的氨基酸序列的碱基序列；表达盒；载体；及转化体；所述多肽的制造方法；以及2‑脱氧‑青蟹肌糖的制造方法。

Mutant 2-deoxy-cyanobacter inosaccharidase

Polypeptide, which has a specific amino acid mutation at least one of the amino acid residues at 14, 37, 290, 293 and 319 from the N-terminal of the amino acid sequence of serial number 1 or its similar sequence; polynucleotide, which has a base sequence encoding the amino acid sequence of the polypeptide; expression box; carrier; and trans The preparation method of the peptide and the 2 \u2011 deoxy \u2011 green crab inosose.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】突变型2-脱氧-青蟹肌糖合酶
本公开文本涉及例如经修饰的2-脱氧-青蟹肌糖(2-deoxy-scyllo-inosose)(以下称为“DOI”)合酶、编码该经修饰的DOI合酶的基因、包含该基因的表达盒、含有该表达盒的载体、含有该载体的转化体、使用了该转化体制造经修饰的DOI合酶的方法、及DOI的制造方法。
技术介绍
塑料、洗涤剂等人们日常生活中身边的制品大多以化石资源作为原料进行制造。作为它们的化工产品原料的六元碳环化合物通过石油化学工业从原油进行生产。但是，在利用从石油制造化学制品原料的以往的石油化学工艺时，存在产生作为有限资源的石油的枯竭及伴随其的价格高涨、由于排放大量的二氧化碳而导致地球变暖等地球规模的问题的顾虑。作为具有六元碳环骨架的手性化合物的DOI是用于合成医药、农药、氧化抑制剂、香料等各种有用化学品的非常重要的中间原料。DOI可合成转变为儿茶酚、杜醌等二元酚、羟基氢醌。例如，Kakinuma等，TetrahedronLetters，2000，vol.41，p.1935公开了将DOI合成转变为儿茶酚。儿茶酚用于神经系统医药品等的原料、食品香料原料、头发护理商品等的抗氧化剂等，氢醌用于止血剂、镇痛剂等的原料、美白剂等化妆品，是世界性高需求的物质。DOI还可转变为作为拟糖的卡巴葡萄糖(carbaglucose)，是用途广泛的中间原料。例如，日本特开2005-053899号公报公开了以DOI作为原料来合成卡巴葡萄糖。已发现，对起始糖类进行碳环化的酶是参与生物合成多种作为临床医学上重要的化学治疗剂的氨基糖苷系抗生素(含2-脱氧链霉胺)的过程的酶之一。由属于丁酰苷菌素产生菌环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)的微生物纯化得到的该酶以葡萄糖-6-磷酸作为底物、以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为辅酶，催化多阶段的反应，最终生物合成DOI。Kudo等，J.Antibiot.，1999，vol.52，p.559及日本特开2000-236881号公报记载了从属于环状芽孢杆菌的微生物克隆其DOI合酶基因(对催化将葡萄糖-6-磷酸转变为DOI的反应的酶进行编码的btrC)，在大肠杆菌内使该基因表达、纯化从而大量得到重组DOI合酶。此外，日本特开2014-064513号公报公开了通过使己糖激酶或多聚磷酸葡萄糖激酶、和DOI合酶作用于葡萄糖的两步酶反应、或者使DOI合酶作用于葡萄糖-6-磷酸的一步酶反应能够合成DOI。此外，Hirayama等，J.Antibiot.，2005，vol.58，p.766公开了来源于弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)的DOI合酶，Subba等，Mol.Cells，2005，vol.20，p.90公开了来源于核糖苷链霉菌(Streptomycesribosidificus)的DOI合酶，Kharel等，Arch.Biochem.Biophys.，2004，vol.429，p.204公开了来源于卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)的DOI合酶，Unwin等，J.Antibiot.，2004，vol.57，p.436公开了来源于棘孢小单胞菌(Micromonosporaechinospora)的DOI合酶，Kharel等，FEMSMicrobiol.Lett.，2004，vol.230，p.185公开了来源于黑暗链霉菌(Streptomycestenebrarius)的DOI合酶，Hirayama等，J.Antibiot.，2006，vol.59，p.358公开了来源于印度斯坦异壁链霉菌(Streptoalloteichushindustanus)的DOI合酶。除此以外，日本特开2013-135697号公报公开了具有特定氨基酸序列的耐热性DOI合酶，Tamegai等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，2010，vol.74，p.1215记载了环状芽孢杆菌的DOI合酶相关蛋白BtrC2的作用。国际公开第2006/109479号及Kogure等，J.Biotechnol.，2007，vol.129，p.502公开了包含DOI合酶的基因的表达盒，还尝试了通过细胞内糖代谢工程修饰来增加产量。国际公开第2010/053052号公开了DOI产生大肠杆菌，其至少具有蔗糖非PTS基因群中编码蔗糖水解酶(CscA)的基因，并且被赋予2-脱氧-青蟹肌糖(DOI)生产系统或对该系统进行了强化，优选还具有糖摄入能力强化系统。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题上述的专利文献及非专利文献中记载的技术并未尝试通过修饰DOI合酶的氨基酸序列来增强DOI合酶活性。为了构建能够使用DOI合酶高效地生产DOI的系统，通过对酶加以修饰来增强酶活性也是有效的手段。若能够提高DOI的生产效率，则能够更廉价地在短时间内大量生产DOI。作为提高酶活性的方法，有修饰酶中与底物结合的活性中心的氨基酸、选择高活性的酶的方法。另外，还有在体外对编码目标酶的基因快速进行人工诱变、从多个突变基因群中筛选编码被修饰为具有目标活性的酶的基因的进化工程方法。后一种方法已被应用于对洗涤剂用酶、生物降解性塑料生产用酶等的修饰，但其对DOI合酶加以修饰的应用尚属未知。本申请的专利技术人着眼于DOI合酶的活性，想到了存在下述的可能性：通过使用具有提高的DOI合成活性的DOI合酶将葡萄糖-6-磷酸高效地转变为DOI，从而能够在短时间内制造大量的DOI。鉴于上述情况，本公开文本涉及的一个实施方式的课题为，提供具有比包含序列号1的氨基酸序列的野生型DOI合酶更高的DOI合成活性的经修饰的DOI合酶、编码该经修饰的DOI合酶的基因、包含该基因的表达盒、含有该表达盒的载体、含有该载体的转化体、使用了该转化体制造经修饰的DOI合酶的方法、及DOI的制造方法。用于解决课题的手段本申请的专利技术人为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果，通过使用进化工程方法，成功地将DOI合酶修饰为DOI合成活性更高的酶。另外，使用含有编码通过该方法得到的经修饰的酶的基因的转化体，成功地比以往更高效地制造了DOI。根据本公开文本，提供以下的(1)～(9)。(1)多肽，其在下述(A1)或(A2)的氨基酸序列中具有下述(a)～(e)中的至少1个氨基酸突变：(A1)序列号1的氨基酸序列；(A2)氨基酸序列，其是具有从葡萄糖-6-磷酸生成2-脱氧-青蟹肌糖的酶活性的多肽的氨基酸序列，且与序列号1的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性；(a)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第14位的天冬酰胺残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为苏氨酸的氨基酸突变；(b)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第37位的酪氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸的氨基酸突变；(c)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第290位的丙氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为苏氨酸的氨基酸突变；(d)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第293位的色氨酸残基在比对上对应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多肽，其在下述(A1)或(A2)的氨基酸序列中具有下述(a)～(e)中的至少1个氨基酸突变：/n(A1)序列号1的氨基酸序列；/n(A2)氨基酸序列，其是具有从葡萄糖-6-磷酸生成2-脱氧-青蟹肌糖的酶活性的多肽的氨基酸序列，且与序列号1的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性；/n(a)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第14位的天冬酰胺残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为苏氨酸的氨基酸突变；/n(b)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第37位的酪氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸的氨基酸突变；/n(c)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第290位的丙氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为苏氨酸的氨基酸突变；/n(d)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第293位的色氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为精氨酸的氨基酸突变；/n(e)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第319位的组氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为精氨酸的氨基酸突变。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170327 JP 2017-0615721.多肽，其在下述(A1)或(A2)的氨基酸序列中具有下述(a)～(e)中的至少1个氨基酸突变：
(A1)序列号1的氨基酸序列；
(A2)氨基酸序列，其是具有从葡萄糖-6-磷酸生成2-脱氧-青蟹肌糖的酶活性的多肽的氨基酸序列，且与序列号1的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性；
(a)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第14位的天冬酰胺残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为苏氨酸的氨基酸突变；
(b)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第37位的酪氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸的氨基酸突变；
(c)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第290位的丙氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为苏氨酸的氨基酸突变；
(d)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第293位的色氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为精氨酸的氨基酸突变；
(e)与序列号1的氨基酸序列的N末端起第319位的组氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基被取代为精氨酸的氨基酸突变。


2.如权利要求1所述的多肽，其在所述(A1)或(A2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：高久洋晓，山崎晴丈，和田光史，宫泽大辅，
申请(专利权)人：学校法人新潟科学技术学园，三井化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP