一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法技术

本发明专利技术提供了一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术的提取方法中应用了LH液，能够显著提高唾液斑miRNA的提取效率。采用本发明专利技术的提取方法得到的唾液斑miRNA能够用于唾液斑miRNA文库的构建，且唾液斑miRNA文库的构建在36h内即可完成，最少仅需1cm

A method of extraction and construction of salivary miRNA high throughput sequencing Library

【技术实现步骤摘要】
一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法。
技术介绍
microRNA(miRNA)是一类长度为16～22个核苷酸的内源性单链非编码RNA，能够与信使RNA的非编码区结合，从而导致基因沉默或抑制基因转录。miRNA在多种体液中广泛表达，包括羊水、乳汁、支气管液、脑脊液、初乳、腹膜液、血浆、胸腔液、唾液、精液、眼泪和尿。作为一种重要的调控因子，miRNA的表达具有组织特异性，目前miRNA成为法庭科学领域新的体液斑鉴定标记物。特别是法医实际案例中的检材通常具有微量、易降解、成分复杂等特点。传统的法医DNA分析在腐败、降解检材等案件中的应用仍然有一定的局限性。而miRNA由于具有长度较短，不易降解等特点，其作为法医新遗传标记的研究具有可观的前景。目前针对miRNA的分析方法主要有荧光定量PCR和高通量测序方法，高通量测序技术具有效率高，通量高，能有效检出基因多态性等特点，成为目前miRNA表达谱检测的主流方法之一。但是高通量测序方法所需模板量大，通常需要100ng以上总RNA，不适用于体液斑等痕量样本，且应用传统方法进行唾液斑miRNA提取，效率低，难以满足高通量测序的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种唾液斑miRNA的提取方法和构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，该唾液斑miRNA的提取方法提取效率高；该唾液斑miRNA高通量测序文库建立的方法能够显著缩短时间，且对样品的需求量小。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种唾液斑miRNA的提取方法，包括以下步骤：1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；2)将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；3)将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；4)将所述第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；5)将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；步骤2)中所述1.5×LH液包括以下浓度的组分：硫氰酸胍5～7mol/L和柠檬酸钠35～40mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水；所述酚氯仿包括以下体积份的组分：酚4.5～5.4份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度为4～4.5mol/L。优选的，步骤1)中所述唾液斑样本的面积≥1cm2；所述唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液的体积比为20～40μL：1mL。优选的，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤2)中所述1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液的用量为1～1.5mL：4～6mL：0.3-0.5mL。优选的，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤3)中所述异丙醇的用量为300～500μL。优选的，步骤4)中所述氯化钠水溶液中氯化钠的浓度为0.2mol/L；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述氯化钠水溶液的用量为150～250μL，所述乙醇的用量为300～500μL。优选的，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤5)中所述乙醇的用量为300～500μL。本专利技术还提供了上述方案任意一项所述提取方法得到的唾液斑miRNA。本专利技术还提供了一种利用上述方案所述唾液斑miRNA构建唾液斑miRNA高通量测序文库的方法，包括以下步骤：S1.唾液斑miRNA连接3'SR接头和5'SR接头，得到连接接头的RNA；所述3'SR接头的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述5'SR接头的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；S2.对所述连接接头的RNA进行逆转录，得到逆转录产物；S3.对所述逆转录产物进行PCR扩增，得到cDNA构建体；S4.对所述cDNA构建体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收146～153bp大小的片段，得到测序文库。优选的，步骤S3中所述PCR扩增的反应体系以100μL计包括：LongAmpTaq2XMasterMix50μL、SR引物2.5μL、IndexX引物2.5μL、无核酸酶水5μL和逆转录产物40μL；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性15s、62℃退火30s、70℃延伸15s，18个循环；70℃再延伸5min；所述SR引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述IndexX引物选自第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物中的一个；所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物、第八引物、第九引物、第十引物、第十一引物和第十二引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO：4～SEQIDNO：15所示。优选的，在步骤S4切胶回收146～153bp大小的片段后，还包括将回收的片段和DNA凝胶洗脱缓冲液，于20～25℃、50rpm下旋转10h，回收洗脱液，将回收的洗脱液、线性丙烯酰胺、乙酸钠水溶液和乙醇混合后，于-80℃下冷冻2h，离心，取沉淀重悬于TE缓冲液，得到测序文库。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种唾液斑miRNA的提取方法，本专利技术的提取方法中应用了1.5×LH液和酚氯仿；所述1.5×LH液包括硫氰酸胍和柠檬酸钠，硫氰酸胍作为离液剂和强变性剂，有助于核酸的分离，柠檬酸钠用于调节pH值；所述酚氯仿使蛋白质变性，同时抑制了RNA酶的降解作用。本专利技术将1.5×LH液用于提取痕量唾液斑miRNA能够达到很好的效果，能够显著提高唾液斑miRNA的提取效率。采用本专利技术的提取方法得到的唾液斑miRNA能够用于唾液斑miRNA文库的构建，且唾液斑miRNA文库的构建在36h内即可完成，最少仅需1cm2陈旧唾液斑(约含10ngRNA)样品即可。本专利技术的方法有利于对陈旧唾液斑的分析，填补了法医学领域空白，为扩展miRNA在法医学方面的应用提供有力的技术支持。附图说明图1为应用安捷伦Agilent2100生物分析仪对是实施例1的miRNA文库进行的DNA电泳结果；图2为人唾液斑表达水平最高的miRNA统计结果。具体实施方式本专利技术提供了一种唾液斑miRNA的提取方法，包括以下步骤：1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；2)将所述第一上清液、1.5×本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种唾液斑miRNA的提取方法，包括以下步骤：/n1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；/n2)将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；/n3)将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；/n4)将所述第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；/n5)将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；/n步骤2)中所述1.5×LH液包括以下浓度的组分：硫氰酸胍5～7mol/L和柠檬酸钠35～40mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水；所述酚氯仿包括以下体积份的组分：酚4.5～5.4份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度为4～4.5mol/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种唾液斑miRNA的提取方法，包括以下步骤：
1)取唾液斑样本和磷酸缓冲盐溶液混合，于300～500g下离心25～35min，取第一上清液；
2)将所述第一上清液、1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液混合，震荡，冰浴5～10min，于10000～12000g下离心15～25min，取上层水相；
3)将所述上层水相和异丙醇混合，于4℃下静置3～5h后，于10000～12000g下离心10～20min，取第一沉淀；
4)将所述第一沉淀和氯化钠水溶液混合后，得到混合液，在混合液中加入乙醇，于-20℃放置0.5～1.5h后，10000～12000g下离心10～20min，取第二上清液；
5)将所述第二上清液和乙醇混合，于-20℃放置0.5～1.5h后，取第二沉淀，于20～30℃下干燥10～20min，得到唾液斑miRNA；
步骤2)中所述1.5×LH液包括以下浓度的组分：硫氰酸胍5～7mol/L和柠檬酸钠35～40mmol/L，所述1.5×LH液的溶剂为水；所述酚氯仿包括以下体积份的组分：酚4.5～5.4份和氯仿1份；所述乙酸钠水溶液中乙酸钠的浓度为4～4.5mol/L。


2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述唾液斑样本的面积≥1cm2；所述唾液斑样本所含唾液量和磷酸缓冲盐溶液的体积比为20～40μL：1mL。


3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤2)中所述1.5×LH液、酚氯仿和乙酸钠水溶液的用量为3～5mL：7～9mL：0.3～0.8mL。


4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，步骤3)中所述异丙醇的用量为300～500μL。


5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤4)中所述氯化钠水溶液中氯化钠的浓度为0.2mol/L；以唾液斑样本的取样量为20～40μL计，所述氯化钠水溶液的用量为150～250μL，所述乙醇的用量为300～500μL。


6.根据权利要求1所述的提取方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：方晨，武会娟，严江伟，刘旭，钱嘉林，李宝明，刘文丽，张小莉，
申请(专利权)人：北京市理化分析测试中心，
类型：发明
国别省市：北京;11