一种扩增CTLA4基因SNP位点用引物、检测试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种扩增CTLA4基因SNP位点用引物、检测试剂盒和应用，属于基因分型检测技术领域。一种扩增CTLA4基因SNP位点用引物，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物。本发明专利技术还提供了检测CTLA4基因SNP位点基因型的引物组包括所述扩增CTLA4基因SNP位点用引物和单碱基延伸引物。所述引物组基于SNaPshot SNP分型技术检测CTLA4基因的rs4553808位点，能够准确得到不同样本CTLA4基因的SNP基因型，因此所述引物组在检测指导泼尼松用药的基因位点多态性中的应用，同时为辅助选择多发性骨髓瘤患者化疗用药研究奠定基础。研究奠定基础。研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种扩增CTLA4基因SNP位点用引物、检测试剂盒和应用


[0001]本专利技术属于基因分型检测
，具体涉及一种扩增CTLA4基因SNP位点用引物、检测试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]多发性骨髓瘤(Mulitiple myeloma,MM)是血液系统第二大恶性肿瘤，通常表现为骨髓中浆细胞过度增生，肿瘤细胞产生大量单克隆免疫球蛋白并出现于患者血和(或)尿中，称为M蛋白，引起骨痛、病理性骨折、造血异常、单克隆球蛋白血症及肾功能受损等一系列临床变化。目前，MM仍不可治愈，依靠药物治疗仅提高患者5～7年的生存时间，联合硼替佐米、美法仑和泼尼松(称MP方案)是临床治疗的常见化疗方案。
[0003]SNaPshot基因分型技术是由美国ABI公司开发的一种基于荧光标记单碱基延伸链终止反应原理的分型技术，具有检测速度快、检测准确、灵敏度高的特点，使用0.5ng DNA即可进行检测。其原理是在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临SNP位点5
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端的不同长度延伸引物和模板DNA的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪检测后，根据峰的位置确定该延伸产物对应的SNP位点，而根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。
[0004]然而，目前还未有关于采用SNaPshot基因分型技术对临床辅助检测多发性骨髓瘤患者的基因型的报道。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种扩增CTLA4基因SNP位点用引物、检测试剂盒和应用，基于SNaPshot基因分型技术对能够影响多发性骨髓瘤患者在接受MP方案治疗后的副作用的CTLA4基因的rs4553808位点多态性进行检测，确定多发性骨髓瘤患者的基因型，为后续选择用药提供基础。
[0006]本专利技术提供了一种扩增CTLA4基因SNP位点用引物，包括上游引物和下游引物；
[0007]所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0008]所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]本专利技术提供了一种基于SNaPshot SNP分型技术检测CTLA4基因SNP位点基因型的引物组，包括所述扩增CTLA4基因SNP位点用引物和单碱基延伸引物；
[0010]所述单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0011]本专利技术提供了所述扩增CTLA4基因SNP位点用引物或所述引物组在辅助选择多发性骨髓瘤患者化疗用药中的应用。
[0012]本专利技术提供了所述扩增CTLA4基因SNP位点用引物或所述引物组在检测指导泼尼松用药的基因位点多态性中的应用。
[0013]本专利技术提供了一种基于SNaPshot SNP分型技术检测CTLA4基因SNP位点基因型的试剂盒，包括所述扩增CTLA4基因SNP位点用引物或所述引物组。
[0014]本专利技术提供了所述基于SNaPshot SNP分型技术检测CTLA4基因SNP位点基因型的试剂盒，还包括1
×
HotStarTaq buffer、Mg
2+
、dNTP、HotStarTaq polymerase和SNaPshot Multiplex Kit。
[0015]本专利技术提供了所述基于SNaPshot SNP分型技术检测CTLA4基因SNP位点基因型的试剂盒在检测指导泼尼松用药的基因位点多态性中的应用。
[0016]本专利技术提供了所述基于SNaPshot SNP分型技术检测CTLA4基因SNP位点基因型的试剂盒在辅助选择多发性骨髓瘤患者化疗用药中的应用。
[0017]本专利技术提供了一种检测CTLA4基因SNP位点基因型的方法，包括以下步骤：
[0018]1)提取待检测样本的基因组DNA；
[0019]2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，用所述扩增CTLA4基因SNP位点用引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0020]3)将所述PCR扩增产物在所述引物组中单碱基延伸引物的作用下进行单碱基延伸反应，得到延伸产物；
[0021]4)将所述延伸产物进行测序，得到待测样本的CTLA4基因SNP基因型。
[0022]优选的，步骤2)中所述PCR扩增的反应程序为95℃，5min；94℃20s，60℃，30s，75℃，1.5min，31循环；72℃，2min；
[0023]步骤2)中所述PCR扩增的反应体系为10μl，包括1
×
HotStarTaq buffer1μl、25mM Mg
2+
0.6μl、10mM dNTP0.2μl、1U HotStarTaq polymerase0.15μl、1μl样本DNA和1μM上游引物0.5μl和1μM下游引物0.5μl，ddH2O补充至10μl。
[0024]步骤3)中所述单碱基延伸反应的反应体系为10μl，包括5μl SNaPshot Multiplex Kit、2μl PCR扩增产物、1μl浓度为1μM延伸引物和2μl超纯水；
[0025]步骤3)中所述单碱基延伸反应的反应程序：96℃，1min；96℃10s，55
°
5s，60℃30s，28个循环。
[0026]本专利技术提供的扩增CTLA4基因SNP位点用引物，是针对CTLA4基因rs4553808位点设计的特异性PCR扩增引物，所述引物能够准确地扩增出包含rs4553808位点的CTLA4基因片段，具有特异性高、扩增准确的特点。
[0027]本专利技术提供的检测CTLA4基因SNP位点基因型的引物组，是基于SNaPshot SNP分型技术进行设计得到。实验表明，采用本专利技术提供的引物组对CTLA4基因SNP位点基因型进行检测，20例体检样本检测结果与Sanger测序法结果完全一致，显示本专利技术所述的引物组检测准确性为100％。本专利技术提供的引物组检测结果准确高的特点，相对于一代测序本身测序反应开始前期的噪音峰的干扰容易造成检测结果不准确的问题具有无法比拟的优势。同时根据测序峰图可知，引物峰消失，产物进行了充分扩增，每个基因型的结果峰高比例清晰，彼此分离，互相无相交，表明本专利技术的引物特异性和重复性良好，灵敏度高。此外，本专利技术提供的引物组还具有检测成本低的优点，避免TaqMan qPCR方法中使用的探针价格高，需要检测大量样本才能平摊探针的成本的缺陷。
[0028]本专利技术提供的检测CTLA4基因SNP位点基因型的方法，是以所述引物扩增和单碱基延伸引物进行的检测，能够准确检测待测样本CTLA4基因rs4553808位点SNP基因型为AA或AG。实验表明，20个样品中的出现的基因型的占比分别为AA(75.0％)、AG(25.0％)，与千人基因中的中国汉族的数据中AA(76.7％)、AG(23.3％)、GG(0.0％)基本一致，说明本专利技术提
供的检测方法具有较高的检测准确性。同时，该方法灵敏度高，仅需0.5ng DNA即可实现，广泛适本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种扩增CTLA4基因SNP位点用引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.一种基于SNaPshot SNP分型技术检测CTLA4基因SNP位点基因型的引物组，其特征在于，包括权利要求1所述扩增CTLA4基因SNP位点用引物和单碱基延伸引物；所述单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.权利要求1所述扩增CTLA4基因SNP位点用引物或权利要求2所述引物组在辅助选择多发性骨髓瘤患者化疗用药中的应用。4.权利要求1所述扩增CTLA4基因SNP位点用引物或权利要求2所述引物组在检测指导泼尼松用药的基因位点多态性中的应用。5.一种基于SNaPshot SNP分型技术检测CTLA4基因SNP位点基因型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述扩增CTLA4基因SNP位点用引物或权利要求2所述引物组。6.根据权利要求5所述基于SNaPshot SNP分型技术检测CTLA4基因SNP位点基因型的试剂盒，其特征在于，还包括1
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HotStarTaqbuffer、Mg
2+
、dNTP、HotStarTaqpolymerase和SNaPshot Multiplex Kit。7.权利要求5或6所述基于SNaPshot SNP分型技术检测CTLA4基因SNP位点基因型的试剂盒在检测指导泼尼松用药的基因位点多态性中的应用。8.权利要求5或6所述基于SNaPshot SNP分型技术检测CTLA4基因SNP...

【专利技术属性】
技术研发人员：马凯，高丽娟，田彦捷，胡丹丹，刘清珺，夏勇其，魏颖，朱博兰，
申请(专利权)人：北京市理化分析测试中心，
类型：发明
国别省市：