一种基因定点突变的方法技术

本发明专利技术公开一种基因定点突变的方法，所述基因定点突变的方法包括以下步骤：以重叠延伸PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段；将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒。本发明专利技术通过先对目标基因片段进行重叠延伸PCR扩增，以对目标基因片段进行定点突变，得到含有突变位点的基因片段，然后将该含有突变位点的基因片段与连入合适的载体，即可获得重组质粒，作为重叠延伸PCR法的扩展，避免了以重叠延伸PCR法直接对长基因进行全长基因扩增时，难以获得含有突变位点的扩增产物的问题，提供了一种适用于长基因定点突变的有效方法。

A method of site directed gene mutation

【技术实现步骤摘要】
一种基因定点突变的方法
本专利技术涉及分子生物
，特别涉及基因定点突变
，具体涉及一种基因定点突变的方法。
技术介绍
基因定点突变是常用的分子生物学技术，是蛋白质结构与功能研究的基础手段。目前基因定点突变主要采用基于聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)的突变引入办法。最早开发出来的重叠延伸PCR(overlapextensionPCR,OE-PCR)是基因突变的主要方法，近年来还发展出大引物法与滚环扩增法等定点突变方法。这些方法各有优劣，不同实验室在选择基因定点突变方法时有所偏好。OE-PCR包括两轮扩增，第一轮PCR分别扩增基因上、下游片段，第二轮PCR通过上、下游片段的末端重叠延伸产物作为模板扩增全长基因。很多科研工作者都有类似的经验，即上、下游片段较小时，第二轮PCR容易成功；随着上、下游基因片段长度增加，第二轮PCR成功率逐渐降低；当某一片段超过2kb时，第二轮PCR不易获得目标产物。一般认为是较长的基因片段干扰了上、下游片段的末端互补所致。另一方面，PCR体外扩增DNA时总是存在随机突变的可能，而且随着目标产物长度增加，随机突变的概率也逐渐增加。由于以上两点，OE-PCR在制作长基因定点突变时往往并不顺利。因此，在遇到相应问题时，有科研工作者会转向滚环扩增法。滚环扩增法也是目前市场上大多数突变试剂盒所采用的基本原理，如NEBQ5,StratageneQuikChange及碧云天QuickMutation基因定点突变试剂盒等。然而，滚环扩增法也存在固有缺陷：其一，PCR扩增7-12kb质粒依赖于高保真、快速且稳定的DNA聚合酶，否则无法得到目标产物或容易引入随机突变；其二，若DpnI酶未能对模板质粒做彻底消化，则会严重干扰目标突变质粒的筛选。尽管所有试剂盒厂商都声称其所含上述两酶都满足要求，但随着试剂盒使用和存储时间增加，不可避免的酶活性降低就会极大地影响基因突变的效率。其三，体外扩增的DNA须经测序确认后才会用于后续研究。这一缺陷于滚环扩增法尤为明显，因为该法需对质粒全长作扩增，而长质粒测序既耗时又会增加额外费用。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种基因定点突变的方法，旨在提供一种适用于长基因定点突变的有效方法。为实现上述目的，本专利技术提出一种基因定点突变的方法，包括以下步骤：以重叠延伸PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段；将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒。可选地，所述质粒载体来源于获得所述目标基因片段的原始质粒。可选地，所述目标基因片段两端分别具有第一酶切位点和第二酶切位点，且所述第一酶切位点在所述原始质粒上不单一，所述原始质粒还包括通过所述第一酶切位点与所述目标基因片段连接的第二基因片段，所述第二基因片段的另一端具有第三酶切位点；对应地，将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒的步骤，包括：先将所述含有突变位点的基因片段通过所述第一酶切位点与所述第二基因片段连接，再通过所述第二酶切位点和第三酶切位点与质粒载体连接，获得重组质粒。可选地，所述目标基因片段来源于视网膜母细胞瘤基因。可选地，所述目标基因片段为所述视网膜母细胞瘤基因编码区1968-2787位的基因片段。可选地，以重叠延伸PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段的步骤，包括：以重叠延伸PCR法，将所述视网膜母细胞瘤基因编码区2338-2339位的TC定点突变为GA。可选地，所述重叠延伸PCR法中，采用的上游引物包括引物S2和引物780E_A，所述下游引物包括引物780E_S和引物pEGFP_C3’，其中：所述引物S2的序列为GCCATTGAAATCTACCTCTCT；所述引物780E_A的序列为ATTGGTTCCAAGGTAGGGGG；所述引物780E_S的序列为ACCTTGGAACCAATACCTCA；所述引物pEGFP_C3’的序列为TATGGCTGATTATGATCAGT。本专利技术提供的技术方案中，通过先对目标基因片段进行重叠延伸PCR扩增，以对目标基因片段进行定点突变，得到含有突变位点的基因片段，然后将该含有突变位点的基因片段与连入合适的载体，即可获得重组质粒，本基因定点突变的方法作为重叠延伸PCR法的扩展，避免了以重叠延伸PCR法直接对长基因进行全长基因扩增时，难以获得含有突变位点的扩增产物的问题，提供了一种适用于长基因定点突变的有效方法。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术提供的基因定点突变的方法的一实施例中的双片段连接示意图；图2为本专利技术提供的基因定点突变的方法的一实施例中基因片段与载体的酶切结果图；图3至图7为实施例中制得的重组质粒的PCR检测结果图；图8为实施例中制得的重组质粒的序列测试结果图。本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本专利技术要求的保护范围之内。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。重叠延伸PCR(overlapextensionPCR,OE-PCR)是基因突变的主要方法，OE-PCR包括两轮扩增，第一轮PCR分别扩增基因上、下游片段，第二轮PCR通过上、下游片段的末端重叠延伸产物作为模板扩增全长基因。很多科研工作者都有类似的经验，即上、下游片段较小时，第二轮PCR容易成功；随着上、下游基因片段长度增加，第二轮PCR成功率逐渐降低；当某一片段超过2kb时，第二轮PCR不易获得目标产物。一般认为是较长的基因片段干扰了上、下游片段的末端互补所致。另一方面，PCR体外扩增DNA时总是存在随机突变的可能，而且随着目标产物长度增加，随机突变的概率也逐渐增加。由于以上两点，OE-PCR在制作长基因定点突变时往往并不顺利。鉴于此，本专利技术提出一种基因定点突变的方法，以OE-PCR为基础，对含有目标突变位点的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因定点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n以重叠延伸PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段；/n将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因定点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以重叠延伸PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段；
将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒。


2.如权利要求1所述的基因定点突变的方法，其特征在于，所述质粒载体来源于获得所述目标基因片段的原始质粒。


3.如权利要求2所述的基因定点突变的方法，其特征在于，所述目标基因片段两端分别具有第一酶切位点和第二酶切位点，且所述第一酶切位点在所述原始质粒上不单一，所述原始质粒还包括通过所述第一酶切位点与所述目标基因片段连接的第二基因片段，所述第二基因片段的另一端具有第三酶切位点；
对应地，将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒的步骤，包括：先将所述含有突变位点的基因片段通过所述第一酶切位点与所述第二基因片段连接，再通过所述第二酶切位点和第三酶切位点与质粒载体连接，获得重组质粒。


4.如权利要求1所述的基因定点突变的方法，其特征在于，所述目标基因片段来源于视网膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：王万林，刘秀红，肖娟，陈华波，翟立红，赵宝明，沈小芳，
申请(专利权)人：湖北文理学院，
类型：发明
国别省市：湖北;42