具有改变的PAM特异性的CPF1(CAS12a)的变体制造技术

具有改善的靶向范围和增强的中靶活性的工程化的普氏菌属和弗朗西斯氏菌属源的CRISPR 1(Cpf1)核酸酶，以及它们在基因组工程化、表观基因组工程化、碱基编辑、基因组靶向、基因组编辑和体外诊断中的用途。

Variants of cpf1 (cas12a) with altered PAM specificity

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改变的PAM特异性的CPF1(CAS12a)的变体优先权声明本申请要求2017年4月21日提交的美国专利申请系列号No.62/488,426，以及2018年1月11日提交的美国专利申请系列号No.62/616,066的权益。上述的全部内容通过引用并入本文。联邦政府赞助的研究或开发本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的拨款号No.GM105378和GM118158的政府支持下完成的。美国政府在本专利技术中享有一定的权利。
本专利技术至少部分地涉及具有改变和改进的目标特异性的、工程化的普氏菌属(Prevotella)和弗朗西斯氏菌属(Francisella)CRISPR1(CRISPRfromPrevotellaandFrancisella1，Cpf1)核酸酶，以及它们在基因组工程、表观基因组工程、基因组靶向、基因组编辑和体外诊断中的用途。
技术介绍
CRISPR-CasCpf1核酸酶(也称为Cas12a核酸酶)最近被描述为基因组编辑应用中作为对Cas9核酸酶的替代(Zetsche等人.Cell163,759-771(2015)；Shmakov等人,MolCell.2015Nov5；60(3):385-97；Kleinstiver等人,NatBiotechnol.2016Aug；34(8):869-74；Kim等人,NatBiotechnol.2016Aug；34(8):863-8)。Cpf1核酸酶拥有许多潜在有益的性质，包括但不限于：识别富T前间区序列邻近基序(T-richprotospacer-adjacentmotif，PAM)序列，与野生型化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9(SpCas9)相比在人类细胞中相对更大的基因组广度的特异性，简化了多个位点的同时靶向(多重化)的加工pre-crRNA的核糖核酸内切酶活性，产生5'DNA突出端的DNA核酸内切酶活性(而不是SpCas9观察到的平端的双链断裂)，以及在距离PAM的最远端切割前间区序列的DNA序列(与用SpCas9和SaCas9观察到的在前间区序列的PAM近端切割相比)。迄今为止，来自氨基酸球菌种(Acidaminococcussp.)BV3L6、毛螺旋菌科细菌(Lachnospiraceaebacterium)ND2006和土拉弗朗西斯氏菌新杀手亚种(Francisellatularensissubsp.novicida)U112的Cpf1直系同源基因(分别为AsCpf1、LbCpf1和FnCpf1)是已被描述为在人类细胞中强健地起作用的仅有的直系同源基因。虽然有这些能力，与SpCas9相比，Cpf1核酸酶没有那么快地用于基因组编辑。一种可能的原因是需要更长的PAM，与SpCas9的每8bp一次相比，其将靶向限制到大约每43bp的随机DNA序列中一次。在此我们通过利用结构导向的工程化方法来产生不仅具有大幅扩展的靶向范围、还具有实质上改进的中靶活性的AsCpf1变体解决了这种靶向范围限制。除了作为用于基因组编辑的核酸酶的改进的效力和多面性之外，我们证实了这些变体还可以用于其他应用，包括多重核酸酶靶向、表观基因组编辑，C-T碱基编辑和Cpf1介导的DNA检测，都是野生型AsCpf1以前不可能达到的水平。
技术实现思路
本文描述的是一系列AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1变体，与它们的野生型对应物相比识别更广范围的PAM，从而提高了可以通过这类RNA-指导核酸酶靶向的位点的范围。此外，在识别和修饰带有典型的TTTNPAM的目标位点方面，这些变体比野生型Cpf1核酸酶表现更好。本文描述的变体的增强的活性改善了AsCpf1用于基因组编辑、表观基因组编辑、碱基编辑和体外DNA检测的活性。因而，本文提供的是分离的、来自氨基酸球菌种BV3L6的、普氏菌属和弗朗西斯氏菌属源的CRISPR1(Cpf1)蛋白(AsCpf1)，其包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列至少80％相同并在以下位置中的一处或多处具有突变的序列：SEQIDNO:2的E174、S170、K548、N551、T167、T539、N552、M604和/或K607。在某些实施方案中，所述分离的Cpf1蛋白包含E174R处的突变，任选地在S170R、K548、N551、T167、T539、S542、N552、M604和/或K607处具有一个或多个额外的突变。在某些实施方案中，所述分离的Cpf1蛋白包括S170R的突变，任选地在E174R、K548、N551、T167、T539、S542、N552、M604和/或K607处具有一个或多个额外的突变。在某些实施方案中，所述分离的Cpf1蛋白包括S542处的突变。在某些实施方案中，所述分离的Cpf1蛋白包括突变S542Q、S542K或S542R。在某些实施方案中，所述分离的Cpf1蛋白包括与SEQIDNO:2的氨基酸序列至少95％相同的序列。在某些实施方案中，所述分离的Cpf1蛋白包括一个或多个以下突变：E174R、S170R、K548R、S170K、E174K、T167A、T539K、T539R、K548V、N551R、N552R、M604A、K607Q、K607R、K607S和/或K607H。在某些实施方案中，所述分离的Cpf1蛋白包括以下突变：SEQIDNO:2的S170R/E174R、E174R/K548R、S170R/K548R、E174R/S542R、S170R/S542R、E174R/S542R/K548R、E174R/N551R、S170R/N551R、S542R/K548R、S542R/N551R、S542R/N552R、K548R/N551R、S170R/S542R/K607R、E174R/S542R/K607R、E174R/S542R/K607H、E174R/S542R/K548R/N551R、S170R/S542R/K548V/N552R、E174R/S542R/K548V/N552R、S170R/S542R/K607R或E174R/S542R/K607R。在某些实施方案中，所述分离的Cpf1蛋白包含降低核酸酶活性的一个或多个突变，例如选自由D908、E993、R1226、D1235和/或D1263处的突变组成的组，优选选自由D908A、E993A、R1226A、D1235A和/或D1263A组成的组。在某些实施方案中，所述分离的Cpf1蛋白包含在N282、N178、S186、N278、R301、T315、S376、N515、K523、K524、K603、K965、Q1013、Q1014和/或K1054中的一处或多处，优选N282、T315、N515或N278处的突变，优选地其中所述突变提高所述蛋白的特异性。在某些实施方案中，所述分离的Cpf1蛋白包括选自由N282A、T315A、N515A或N278A组成的组的突变。本文还提供的是分离的、来自毛螺旋菌科细菌ND2006的、普氏菌属和弗朗西斯氏菌属源的CRISPR1(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的、来自氨基酸球菌种(Acidaminococcus sp.)BV3L6的、普氏菌属和弗朗西斯氏菌属源的CRISPR 1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1)(Cpf1)蛋白(AsCpf1)，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80％相同并在以下位置中的一处或多处具有突变的序列：SEQ ID NO:2的E174、S170、K548、N551、T167、T539、N552、M604和/或K607。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170421 US 62/488,426;20180111 US 62/616,0661.一种分离的、来自氨基酸球菌种(Acidaminococcussp.)BV3L6的、普氏菌属和弗朗西斯氏菌属源的CRISPR1(CRISPRfromPrevotellaandFrancisella1)(Cpf1)蛋白(AsCpf1)，其包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列至少80％相同并在以下位置中的一处或多处具有突变的序列：SEQIDNO:2的E174、S170、K548、N551、T167、T539、N552、M604和/或K607。


2.根据权利要求1所述的分离的Cpf1蛋白，其进一步包含S542处的突变。


3.根据权利要求2所述的分离的蛋白，其包含突变S542Q、S542K或S542R。


4.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列至少95％相同的序列。


5.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其包含一个或多个以下突变：E174R、S170R、K548R、S170K、E174K、T167A、T539K、T539R、K548V、N551R、N552R、M604A、K607Q、K607R、K607S和/或K607H。


6.根据权利要求2所述的分离的蛋白，其包含以下突变：SEQIDNO:2的S170R/E174R、E174R/K548R、S170R/K548R、E174R/S542R、S170R/S542R、E174R/S542R/K548R、E174R/N551R、S170R/N551R、S542R/K548R、S542R/N551R、S542R/N552R、K548R/N551R、S170R/S542R/K607R、E174R/S542R/K607R、E174R/S542R/K607H、E174R/S542R/K548R/N551R、S170R/S542R/K548V/N552R、E174R/S542R/K548V/N552R、S170R/S542R/K607R或E174R/S542R/K607R。


7.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其进一步包含降低核酸酶活性的一个或多个突变，所述突变优选选自由D908、E993、R1226、D1235和/或D1263处的突变组成的组，优选选自由D908A、E993A、R1226A、D1235A和/或D1263A组成的组。


8.根据权利要求6所述的分离的蛋白，其进一步包含降低核酸酶活性的一个或多个突变，所述突变优选选自由D908、E993、R1226、D1235和/或D1263处的突变组成的组，优选选自由D908A、E993A、R1226A、D1235A和/或D1263A组成的组。


9.根据权利要求1-8任一项所述的分离的蛋白，其进一步包含N282、N178、S186、N278、R301、T315、S376、N515、K523、K524、K603、K965、Q1013、Q1014和/或K1054中的一处或多处，优选N282、T315、N515或N278处的突变，优选地其中所述突变提高所述蛋白的特异性。


10.根据权利要求9所述的分离的蛋白，其包含选自由N282A、T315A、N515A或N278A组成的组的突变。


11.一种分离的、来自毛螺旋菌科细菌ND2006的、普氏菌属和弗朗西斯氏菌属源的CRISPR1(Cpf1)蛋白(LbCpf1)，其包含与SEQIDNO:11至少80％相同的序列，在以下位置中的一处或多处具有：SEQIDNO:11的T152、D156、G532和/或K538。


12.根据权利要求11所述的分离的蛋白，其包含与SEQIDNO:11的氨基酸序列至少95％相同的序列。


13.根据权利要求11所述的分离的蛋白，其包含一个或多个以下突变T152R、T152K、D156R、D156K、G532R和/或K538R。


14.根据权利要求11所述的分离的蛋白，其包含以下突变：D156R/G532R/K538R。


15.根据权利要求11所述的分离的蛋白，其进一步包含降低核酸酶活性的一个或多个突变，所述突变例如选自由D832、E925、R1138、D1148和/或D1180处的突变组成的组，优选选自由D832A、E925A、R1138A、D1148A和/或D1180A组成的组。


16.根据权利要求14所述的分离的蛋白，其进一步包含降低核酸酶活性的一个或多个突变，所述突变例如选自由D832、E925、R1138、D1148和/或D1180处的突变组成的组，优选选自由D832A、E925A、R1138A、D1148A和/或D1180A组成的组。


17.根据权利要求11-16任一项所述的分离的蛋白，其进一步包含S202、N274、N278、K290、K367、K532、K609、K915、Q962、K963、K966、K1002和/或S1003的一处或多处的突变，优选地其中所述突变提高所述蛋白的特异性。


18.根据权利要求17所述的分离的蛋白，其包含一个或多个以下突变：S202A、N274A、N278A、K290A、K367A、K532A、K609A、K915A、Q962A、K963A、K966A、K1002A和/或S1003A。


19.一种分离的、来自土拉弗朗西斯氏菌的、普氏菌属和弗朗西斯氏菌属源的CRISPR1(Cpf1)蛋白(FnCpf1)，其包含与SEQIDNO:4至少80％相同并在以下位置中的一处或多处具有突变的序列：SEQIDNO:4的K180、E184、N607、K613、D616、N617和/或K671。


20.根据权利要求19所述的分离的蛋白，其包含与SEQIDNO:4的氨基酸序列至少95％相同的序列。


21.根据权利要求19所述的分离的蛋白，其包含一个或多个以下突变：K180R、E184R、N607R、K613R、K613V、D616R、N617R、K671H和K671R。


22.根据权利要求19所述的分离的蛋白，其包含以下突变：N607R/K613R，N607R/K613V，N607R/K613V/D616R，或N607R/K613R/D616R。


23.根据权利要求19所述的分离的蛋白，其进一步包含降低核酸酶活性的一个或多个突变，所述突变优选地选自由D917、E1006、R1218、D1227和/或D1255处的突变组成的组，优选选自由D917A、E1006A、R1218A、D1227A和/或D1255A组成的组。


24.根据权利要求20所述的分离的蛋白，其进一步包含降低核酸酶活性的一个或多个突变，所述突变优选地选自由D917、E1006、R1218、D1227和/或D1255处的突变组成的组，优选选自由D917A、E1006A、R1218A、D1227A和/或D1255A组成的组。


25.一种融合蛋白，其包含经任选的间插接头与异源功能结构域融合的根据权利要求1-24任一项所述的分离的蛋白，其中所述接头不干扰所述融合蛋白的活性。


26.根据权利要求25...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·K·乔昂格，B·克莱因斯蒂弗，A·苏萨，
申请(专利权)人：通用医疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US