腈水解酶XiNit1及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了腈水解酶XiNit1及其编码基因和应用。本发明专利技术提供的蛋白质，来源于辛芳芳菌(Xinfangfangiasp.)，是一种腈水解酶，命名为XiNit1蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明专利技术还保护XiNit1蛋白作为腈水解酶的应用。本发明专利技术还保护一种用于降解腈类化合物的制剂，其活性成分为XiNit1蛋白。本发明专利技术对于相关化工领域、环境污染治理领域等，具有重大的应用前景。

Nitrile Hydrolase XiNit1 and Its Coding Gene and Application

【技术实现步骤摘要】
腈水解酶XiNit1及其编码基因和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及腈水解酶XiNit1及其编码基因和应用。
技术介绍
腈类化合物是一种重要的有机化工原料，同时也是一种有刺激性气味的有毒物质。在合成橡胶、石油炼制过程的污水中含有众多不同种类的腈类化合物，丙烯腈就是其中的一种重要有毒成分。相比于物理法、化学法在处理腈类化合物过程中的副产物，人们更倾向于采用对环境无害的生物法处理污水中的腈类化合物。生物法相较于物理法和化学法而言，具有反应条件温和、运行稳定且成本低廉的特点。自19世纪以来，利用生物法处理废水中的有机物已成为世界各国的主要方法。利用微生物的代谢功能将废水中的腈类和酚类等有机物降解为水和二氧化碳等，从而达到废水的净化效果。世界上第一株腈水解酶是在19世纪60年代在大麦叶中被发现的，后来证明其在真菌、细菌甚至古菌中也广泛存在。目前人类已从众多不同属种的微生物中发现腈水解酶的存在，例如红细菌、诺卡氏菌、节杆菌等。腈水解酶(Nitrilase,EC3.5.5.1)是属于腈水解酶超家族的一类重要的工业用酶，不仅可以降解水体或土壤中的腈类污染物，还可以将廉价的腈类化合物水解转化为高附加值的工业、食品和医药等产品的中间体，如：丙烯酸、烟酸和手性扁桃酸等。其催化过程温和环保，属于绿色化工。因此，开发具有高活性、高稳定性和极端条件耐受性的腈水解酶，具有重要的应用价值。根据目前的报道，从一种古菌：火球菌Pyrococcussp.中克隆表达的腈水解酶具有较高的温度稳定性，其最适温度为60-90℃，但pH范围较窄(6-8)，且对底物的降解效率非常低。根据底物范围，可以将腈水解酶分为三大类：脂肪腈水解酶、芳香腈水解酶和芳基乙腈类腈水解酶。一般来说，现有报道的腈水解酶只能专一的降解一类腈化物。因此，寻找更为优质的腈水解酶，成为了研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供腈水解酶XiNit1及其编码基因和应用。本专利技术提供的蛋白质，来源于辛芳芳菌(Xinfangfangiasp.)，是一种腈水解酶，命名为XiNit1蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a3)含有(a1)的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有腈水解酶功能的由其衍生的蛋白质。(a7)来源于辛芳芳菌，且与(a1)具有99％以上同源性，且具有腈水解酶功能的蛋白质。标签具体如表1所示。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDLHA9YPYDVPDYAXiNit1蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。所述基因为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；2)编码区如序列表中序列4中第1-891位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有腈水解酶功能蛋白的DNA分子；4)来源于辛芳芳菌，且与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有腈水解酶功能蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护XiNit1蛋白作为腈水解酶的应用。应用XiNit1蛋白作为腈水解酶时，采用的温度为30-80℃，采用的pH为3-11。应用XiNit1蛋白作为腈水解酶时，采用的温度为55℃，采用的pH为7。本专利技术还保护XiNit1蛋白在降解腈类化合物中的应用。应用XiNit1蛋白降解腈类化合物时，采用的温度为30-80℃，采用的pH为3-11。应用XiNit1蛋白降解腈类化合物时，采用的温度为55℃，采用的pH为7。本专利技术还保护XiNit1蛋白在制备腈水解酶中的应用。本专利技术还保护一种用于降解腈类化合物的制剂，其活性成分为XiNit1蛋白。以上任一所述腈类化合物为脂肪族腈类、芳香族腈类或酰基腈类。本专利技术提供的腈水解酶XiNit1具有较高的酶活力，宽泛的底物，并且反应温度宽泛，反应pH宽泛，对于金属离子、金属离子螯合剂、还原剂、有机溶剂和表面活性剂均具有高耐受性。辛芳芳菌(Xinfangfangiasp.)DLY26已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCCNo：M2019001。本专利技术对于相关化工领域、环境污染治理领域等，具有重大的应用前景。附图说明图1为菌株DLY26的照片。图2为系统发生树。图3为细菌生长曲线。图4为气相色谱法检测的色谱图。图5为振荡培养的各个时间点丙烯腈的降解率。图6为SuperdexTM20010/60凝胶层析柱进行分离纯化的色谱图。图7为XiNit1蛋白溶液的电泳图。图8为检测最适pH时的相对酶活结果。图9为检测pH稳定性时的相对酶活结果。图10为检测最适反应温度时的相对酶活结果。图11为检测温度稳定性时的相对酶活结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、辛芳芳菌DLY26的分离、鉴定和保藏一、分离取约1ml活性污泥样品(取自石化炼油化污水处理系统)，用无菌蒸馏水依次稀释至10倍体积、20倍体积、50倍体积、100倍体积和1000倍体积。采用涂布平板法将100μl稀释后样本涂布于固体培养基表面，30℃培养，每天观察表面菌落的生长情况。挑取颜色不同、形态差异的菌落，通过三区划线法进行纯化和培养，直至在培养基表面生长出能够观察到形态、大小等特征都相同的单菌落为止。二、鉴定将纯化获得的菌株接种于TSA平板，30℃培养24h，然后使用透射电子显微镜观察细胞的形态、大小等特征(菌株DLY26的照片见图1)。从培养24h的TSA平板表面挑取单菌落，按照标准方法进行革兰氏染色处理，使用倒置荧光显微镜观察细菌的革兰氏染色情况。制备半固体培养基TSB，采用穿刺接种法观察细菌的运动性和好氧性情况。以液体培养基TSB为基础：配制不同NaCl浓度的培养基体系(NaCl梯度为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0g/100mL)，接种后置于30℃的摇床中振荡培养3-5d，使用UV-2450分光光度计在OD600处检测细菌的其生长情况，以确定最佳盐度生长范围；配制pH值不同的液体培养基(pH梯度设置为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a3)含有(a1)的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有腈水解酶功能的由其衍生的蛋白质。(a7)来源于辛芳芳菌，且与(a1)具有99％以上同源性，且具有腈水解酶功能的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a3)含有(a1)的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有腈水解酶功能的由其衍生的蛋白质。(a7)来源于辛芳芳菌，且与(a1)具有99％以上同源性，且具有腈水解酶功能的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；2)编码区如...

【专利技术属性】
技术研发人员：郗丽君，刘建国，刘德健，张静静，王佳宇，苏石晶，窦珂，王明，谭雯斐，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：山东,37