一种耐高温酸性的果胶酶TsPec及基因与应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及一种耐高温的酸性果胶酶TsPec及基因与应用。所述果胶酶TsPec的核心氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，并且，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中77位和81位的半胱氨酸形成二硫键，194位和210位的半胱氨酸形成二硫键，272位和317位的半胱氨酸形成二硫键。所述果胶酶碱基序列与SEQ ID NO：2的序列具有95％以上的同一性。本发明专利技术显著提高了人工合成的果胶酶基因TsPec在毕赤酵母细胞中的表达量，显著提高了果胶酶的活性、温度稳定性和表达水平，获得了在毕赤酵母中高水平表达的、高酶活力、耐高温的酸性果胶酶及基因。

A Pectinase TsPec with High Temperature and Acidity Resistance and Its Gene and Application

【技术实现步骤摘要】
一种耐高温酸性的果胶酶TsPec及基因与应用
本专利技术属于基因工程
，更具体地，涉及一种耐高温酸性的果胶酶TsPec及基因序列、以及重组表达载体、重组表达菌株、该果胶酶TsPec的应用和一种水解果胶的方法。
技术介绍
果胶是存在于植物的果实等器官中的一种天然高分子产物。它是植物细胞壁的组成成分，是相邻细胞间的粘结物，使植物细胞黏结在一起。天然果胶类物质通常以原果胶、果胶和果胶酸的形态存在于植物组织和器官中。果胶是一种线形的糖类高聚物，其主链主要由半乳糖醛酸聚糖、半乳聚糖和阿拉伯聚糖半乳糖醛酸残基组成，分子量约为50000～150000。作为一种天然高分子化合物，果胶具有良好的胶凝化和乳化稳定作用。广泛用于食品、医药、日化及纺织行业。另一方面，果胶对果汁、果酒等饮料的加工、饲料的营养利用以及造纸和麻类脱胶等均有显著影响。果胶酶是指分解果胶质的酶类的总称。通常包括果胶酯酶、聚半乳糖醛酸、果胶裂解酶等。它们能催化果胶解聚或者催化果胶分子中的酯水解。果胶酶可根据其最适应的作用pH值分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。酸性果胶酶在食品工业应用较为广泛，主要涉及果蔬汁的榨取和澄清、天然产物提取以及饲料加工等。果胶酶可以降解果胶，在很多行业均有应用。果胶酶在果蔬汁澄清、果酒酿造、天然产物提取、榨油、饲料、造纸、纺织、环境保护等领域中均有涉及。果胶酶最先应用于果蔬汁加工工艺中。由于果汁一般为酸性，所以应用的主要为酸性果胶酶。加入果胶酶可以提高出汁率、降低果蔬汁的黏度、增加果蔬汁的透光率。另外将果胶酶与淀粉酶混合处理澄清果汁，可减少50％的过滤时间。在果酒酿造领域，葡萄浆用果胶酶处理后可改善酒的澄清度和成色。果胶酶可以一定程度破坏葡萄的细胞壁，降低果汁的粘度，促进色素的溶解，改善葡萄酒的品质。在榨油加工领域，如果在榨油之前用果胶酶进行前处理，使细胞壁通透，可以提高出油率，增加酚类物含量，改善油的浊度、色泽。在饲料领域，果胶酶加入饲料当中可降低抗营养因子，增加饲料利用率，降低食物糜的黏度，减少家禽粪便量。果胶酶是一种绿色饲料添加剂，在饲料的生产应用中日益普遍。尽管果胶酶在食品、饲料、农产品加工等领域具有广泛的应用前景，但仍然存在需要解决的关键问题：1)酶的比活力低。天然存在的果胶酶活性普遍较低，对果胶的水解效率低。2)果胶酶在工业生产中产量较低，生产成本较高。3)果胶酶的高温稳定性较差，特别是在饲料工业中，高温制粒工艺易使不耐热的果胶酶失去活性。因此，需要对果胶酶进行改造，从而提高酶对温度的稳定性，提高其表达水平。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高水平表达的耐高温酸性果胶酶TsPec及基因序列、以及重组表达载体、重组表达菌株、该果胶酶TsPec的应用和一种水解果胶的方法。本专利技术的果胶酶基因TsPec表达出的果胶酶TsPec的最适宜温度为75℃，最适pH值为5.0。为了实现上述目的，本专利技术提供一种耐高温酸性的果胶酶TsPec，所述果胶酶TsPec的氨基酸序列含有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，并且，SEQIDNO：1所示的氨基酸序列中77位和81位的半胱氨酸形成二硫键，194位和210位的半胱氨酸形成二硫键，272位和317位的半胱氨酸形成二硫键。根据本专利技术，所述果胶酶TsPec的氨基酸序列含有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列即可实现本专利技术的效果。最优选情况下，所述果胶酶TsPec的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，并且，SEQIDNO：1所示的氨基酸序列中77位和81位的半胱氨酸形成二硫键，194位和210位的半胱氨酸形成二硫键，272位和317位的半胱氨酸形成二硫键。根据本专利技术，所述果胶酶TsPec由来自篮状菌(Talaromycessp.)果胶酶Pec(GenBank登录号：XM_002484792.1)通过蛋白质设计的方式引入了三个二硫键，所述果胶酶Pec的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。具体的设计包括：将原始果胶酶Pec序列中77位亮氨酸和81位的苏氨酸(T81)均突变为半胱氨酸(L77C和T81C)，引入一对二硫键；将194位的丙氨酸和210位的缬氨酸均突变为半胱氨酸(A194C和V210C)；将272位的苏氨酸和317位的缬氨酸(T272C和V317C)，引入一对二硫键。重新设计的氨基酸所述可采用本领域常规的各种方法实现，其具体操作步骤为本领域技术人员公知，在此不再赘述。本专利技术的第二方面提供一种耐高温酸性的果胶酶基因TsPec，用于编码果胶酶TsPec。具体地，所述果胶酶基因TsPec的碱基序列与SEQIDNO：3所示的碱基序列具有95％以上的同一性。优选地，根据本专利技术，所述的果胶酶基因TsPec，含有SEQIDNO：3所示的碱基序列即可实现本专利技术的效果。在最优选情况下，本专利技术所述的果胶酶TsPec的碱基序列为SEQIDNO：3所示的碱基序列。本专利技术提供的果胶酶基因TsPec，系基于果胶酶氨基酸序列人工设计。采用了在毕赤酵母中高频使用的密码子，从而显著提高了人工设计的果胶酶基因TsPec在毕赤酵母细胞中的表达量。本专利技术根据果胶酶的氨基酸序列，人工设计出一条全新的果胶酶基因序列，并通过人工合成的方法获得所述果胶酶基因片段，其碱基序列如SEQIDNO：3所示，命名为TsPec，所述果胶酶基因TsPec编码出的果胶酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术的果胶酶基因TsPec表达出的果胶酶TsPec的适宜温度为65-75℃，最适宜温度为75℃，适宜pH值为4.5-5.5，最适pH值为5.0。本专利技术的第三方面提供一种重组表达载体，其包括上述果胶酶基因TsPec，还可包括其他功能单元。在果胶酶TsPec的氨基酸序列和果胶酶基因TsPec的碱基序列确定的情况下，本领域技术人员能够选择合适的重组表达载体以及其他功能单元，例如，毕赤酵母表达载体。本专利技术对所述重组表达载体的制备方法没有特别限定，可根据本领域常规技术手段确定。根据本专利技术一种具体实施方式，所述重组表达载体的制备方法包括以下步骤：将合成的果胶酶基因TsPec连接至表达载体中。在本专利技术的一些实施例中，所述表达载体为毕赤酵母表达载体pPICZαA。当然，在本专利技术其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母表达载体。根据本专利技术一种更加具体的实施方式，所述重组表达载体的制备方法包括如下步骤：将合成的果胶酶基因TsPec通过限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，获得具有粘性末端的果胶酶基因TsPec片段；将毕赤酵母表达载体pPICZαA通过限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，获得具有粘性末端的pPICZαA片段；将果胶酶基因TsPec片段和pPICZαA片段通过T4DNA连接酶连接，获得pPIC-TsPec重组表达质粒。本专利技术的第四方面提供一种重组表达菌株，其表达产物为上述果胶酶TsPec。在果胶酶TsPec的氨基酸序列确定的情况下，本领域技术人员能够获得合适的重组表达菌株。通常来说，所述宿主细胞可以是大肠杆菌、芽孢杆菌、曲霉，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞，例如动物细胞等。优选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。同时，本专利技术提供的果胶酶基因TsPec经过密码子优化，采用了适合于毕赤酵母进行转录翻译表达出果胶酶的高频密码子，提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐高温酸性果胶酶TsPec，其特征在于，所述果胶酶TsPec的氨基酸序列含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，并且，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中77位和81位的半胱氨酸形成二硫键，194位和210位的半胱氨酸形成二硫键，272位和317位的半胱氨酸形成二硫键。

【技术特征摘要】
1.一种耐高温酸性果胶酶TsPec，其特征在于，所述果胶酶TsPec的氨基酸序列含有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，并且，SEQIDNO：1所示的氨基酸序列中77位和81位的半胱氨酸形成二硫键，194位和210位的半胱氨酸形成二硫键，272位和317位的半胱氨酸形成二硫键。2.根据权利要求1所述的果胶酶TsPec，其特征在于，所述果胶酶TsPec的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，并且，SEQIDNO：1所示的氨基酸序列中77位和81位的半胱氨酸形成二硫键，194位和210位的半胱氨酸形成二硫键，272位和317位的半胱氨酸形成二硫键。3.根据权利要求2所述的果胶酶TsPec，其特征在于，所述果胶酶TsPec由果胶酶Pec通过重新设计并引入二硫键得到，所述果胶酶Pec的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。4.一种果胶酶基因TsPec，用于编码权利要求1-3中...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨江科，彭小波，韩正刚，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，中国大洋矿产资源研究开发协会中国大洋事务管理局，
类型：发明
国别省市：湖北,42