本发明专利技术涉及蛋白质药物技术领域，尤其是一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法，包括以下步骤；步骤一：AzMMMan化学修饰蛋白和其与相关分子点击化学交联的制备；步骤二：利用AzMMMan化学修饰Protein A得到Protein A‑AzM‑DBCO‑X；利用AzMMMan化学修饰Protein B得到Protein B‑AzM‑DBCO‑Y；本发明专利技术通过AzMMMan化学修饰的蛋白与其他药物分子点击化学反应交联结合形成纳米颗粒，不仅延长其血液循环时间，而且因EPR效应靶向至肿瘤组织，在酸性条件下可逆释放出蛋白，保留活性，协同治疗,与传统PEG化蛋白类药物来延长半衰期但生物活性大大降低相比，此法可在酸性条件下可逆释放出蛋白药物，保留其生物活性，且该策略可以用做所有体内环境下不稳定或者体内办衰期不够长的药物蛋白的剂型改进。
A Protein Preparation Method Based on Chemical Modification of AzMMMan
【技术实现步骤摘要】
一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法
本专利技术涉及蛋白质药物
，尤其涉及一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法。
技术介绍
蛋白类药物如干扰素（IFN），白介素（IL）等在临床上已经得到了广泛应用，但是，蛋白类药物在体内容易被酶解，失去活性，影响其发挥抗肿瘤作用，点击化学反应，通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成，其代表反应为炔基与叠氮基团的环加成反应，其反应迅速，条件简单，效率高，副产物无害等优点使得点击化学反应在高分子，材料领域得到广泛应用，LinkerAzMMMan，作为马来酸酐衍生物，一方面酸酐键可与蛋白上氨基结合，且酸性条件下可释放出蛋白；另一方面其叠氮基团可与二苯基环辛炔（DBCO）点击化学反应结合，形成牢固的复合物，目前对于蛋白上氨基的化学修饰大多是不可逆的，即修饰后无法恢复到原有状态，使得蛋白生物活性降低或失活。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：设计一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法，包括以下步骤；步骤一：AzMMMan化学修饰蛋白和其与相关分子点击化学交联的制备；S1、有机小分子AzMMMan化学修饰蛋白的制备：利用相关蛋白上侧链氨基与有机小分子AzMMMan的酸酐键在碱性条件下反应，连接形成酰胺键；S2、由AzMMMan修饰后的蛋白与相关分子点击化学交联的制备：利用AzMMMan修饰后的蛋白上带有的叠氮基团与相关分子上被修饰后带有的二苯基环辛炔在弱碱性条件下发生点击化学反应，连接形成氮杂环；步骤二：利用AzMMMan化学修饰ProteinA得到ProteinA-AzM-DBCO-X；利用AzMMMan化学修饰ProteinB得到ProteinB-AzM-DBCO-Y；S1、将CAT溶解于pH9.0的HEPES缓冲溶液中，将由少量乙腈溶解的有机小分子AzMMMan缓慢滴加至改缓冲液中，室温下反应4小时得到CAT-AZ；S2、将Pt-COOH以少量二甲基亚砜为溶剂，EDC/NHS活化半小时，随后将其加入至有HSA的PBS缓冲溶液中且pH8.0，避光反应12小时，再加入由少量乙腈溶解的有机小分子AzMMMan，反应4小时得到Pt(IV)-HSA-AZ；S3、将CAT-AZ、Pt(IV)-HSA-AZ和DBCO-Ce6置于pH8.0的PBS缓冲溶液中避光反应4-6小时得到HSAP-DC-CAT。优选的，所述ProteinA-AzM-DBCO-X中的ProteinA代表辅助药物治疗的相关功能蛋白；X代表Ce6等光动力肿瘤治疗药物、顺铂等化疗药物，或者其他治疗方式的肿瘤药物。优选的，所述ProteinB-AzM-DBCO-Y中的ProteinB代表干扰素或白介素等多肽或蛋白药物；Y代表辅助蛋白药物治疗的相关分子。本专利技术提出的一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法，有益效果在于：1、本专利技术通过AzMMMan化学修饰的蛋白与其他药物分子点击化学反应交联结合形成纳米颗粒，不仅延长其血液循环时间，而且因EPR效应靶向至肿瘤组织，在酸性条件下可逆释放出蛋白，保留活性，协同治疗。2、本专利技术与传统PEG化蛋白类药物来延长半衰期但生物活性大大降低相比，此法可在酸性条件下可逆释放出蛋白药物，保留其生物活性，且该策略可以用做所有体内环境下不稳定或者体内办衰期不够长的药物蛋白的剂型改进。附图说明图1为本专利技术CAT、HAS、光敏分子Ce6和材料HSAP-DC-CAT等的紫外吸收示意图；图2为本专利技术材料HSAP-DC-CAT的透射电镜示意图；图3为本专利技术通过DLS测量得到材料HSAP-DC-CAT等相关粒径以及其在不同pH下的粒径变化情况示意图；图4为本专利技术通过DLS测量得到材料HSAP-DC-CAT等相关粒径以及其在不同pH下的粒径变化情况示意图；图5为本专利技术测定材料HSAP-DC-CAT在含有不同浓度H2O2溶液中产生的溶解氧的能力示意图；图6为本专利技术测定材料HSAP-DC-CAT在含有H2O2溶液中产生单线态氧的能力示意图；图7为本专利技术测定材料HSAP-DC-CAT中过氧化氢酶随时间变化的相对酶活性示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例1、参照图1-7，一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法，包括以下步骤；步骤一：AzMMMan化学修饰蛋白和其与相关分子点击化学交联的制备；S1、有机小分子AzMMMan化学修饰蛋白的制备：利用相关蛋白上侧链氨基与有机小分子AzMMMan的酸酐键在碱性条件下反应，连接形成酰胺键；S2、由AzMMMan修饰后的蛋白与相关分子点击化学交联的制备：利用AzMMMan修饰后的蛋白上带有的叠氮基团与相关分子上被修饰后带有的二苯基环辛炔在弱碱性条件下发生点击化学反应，连接形成氮杂环；步骤二：利用AzMMMan化学修饰ProteinA得到ProteinA-AzM-DBCO-X；利用AzMMMan化学修饰ProteinB得到ProteinB-AzM-DBCO-Y；所述ProteinA-AzM-DBCO-X中的ProteinA代表辅助药物治疗的相关功能蛋白，任何带-NH2的蛋白质或功能蛋白质，或药物蛋白质；X代表Ce6等光动力肿瘤治疗药物、顺铂等化疗药物，或者其他治疗方式的肿瘤药物，DBCO-X为所有与二苯并环辛炔相连的分子；所述ProteinB-AzM-DBCO-Y中的ProteinB代表干扰素或白介素等多肽或蛋白药物，任何带-NH2的蛋白质或功能蛋白质，或药物蛋白质；Y代表辅助蛋白药物治疗的相关分子。S1、将CAT溶解于pH9.0的HEPES缓冲溶液中，将由少量乙腈溶解的有机小分子AzMMMan缓慢滴加至改缓冲液中，室温下反应4小时得到CAT-AZ；S2、将Pt-COOH以少量二甲基亚砜为溶剂，EDC/NHS活化半小时，随后将其加入至有HSA的PBS缓冲溶液中且pH8.0，避光反应12小时，再加入由少量乙腈溶解的有机小分子AzMMMan，反应4小时得到Pt(IV)-HSA-AZ；S3、将CAT-AZ、Pt(IV)-HSA-AZ和DBCO-Ce6置于pH8.0的PBS缓冲溶液中避光反应4-6小时得到HSAP-DC-CAT；实施例，蛋白质的氨基与linker小分子AzMMMan发生共价反应；蛋白质酶（CAT，HAase）与酸性可逆的linker小分子AzMMMan发生共价反应形成酰胺键，DBCO-Ce6将AzMMMan修饰的CAT、HAase交联成的纳米颗粒，交联的纳米颗粒在血液的pH环境中比较稳定，但在肿瘤组织的微酸环境中，CAT、HAas与linker分子形成的酰胺键可以可逆断裂；通过化学修饰对蛋CAT，HAase活性的精细调控，以期实现对蛋白酶在生物体内的活性可控释放；具体实施时，（1）研究各种浓度纳米材料的进细胞效率；（2）用激光扫描共聚焦显微镜进行活细胞成像的研究；（3）再研究对照组和治疗组在不同浓度下对4T1细胞的毒性作用；（4）进行分组，如下：Ce6（红外光+，红本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法，其特征在于：包括以下步骤；步骤一： AzMMMan化学修饰蛋白和其与相关分子点击化学交联的制备；S1、有机小分子AzMMMan化学修饰蛋白的制备：利用相关蛋白上侧链氨基与有机小分子AzMMMan的酸酐键在碱性条件下反应，连接形成酰胺键；S2、由AzMMMan修饰后的蛋白与相关分子点击化学交联的制备：利用AzMMMan修饰后的蛋白上带有的叠氮基团与相关分子上被修饰后带有的二苯基环辛炔在弱碱性条件下发生点击化学反应，连接形成氮杂环；步骤二：利用AzMMMan化学修饰Protein A得到Protein A‑AzM‑DBCO‑X；利用AzMMMan化学修饰Protein B得到Protein B‑AzM‑DBCO‑Y；S1、将CAT溶解于pH 9.0的HEPES缓冲溶液中，将由少量乙腈溶解的有机小分子AzMMMan缓慢滴加至改缓冲液中，室温下反应4小时得到CAT‑AZ；S2、将Pt‑COOH以少量二甲基亚砜为溶剂，EDC/NHS活化半小时，随后将其加入至有HSA的PBS缓冲溶液中且pH 8.0，避光反应12小时，再加入由少量乙腈溶解的有机小分子AzMMMan，反应4小时得到Pt(IV)‑HSA‑AZ ；S3、将CAT‑AZ、Pt(IV)‑HSA‑AZ和DBCO‑Ce6 置于pH8.0的PBS缓冲溶液中避光反应4‑6小时得到HSAP‑DC‑CAT。...
【技术特征摘要】
1.一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法，其特征在于：包括以下步骤；步骤一：AzMMMan化学修饰蛋白和其与相关分子点击化学交联的制备；S1、有机小分子AzMMMan化学修饰蛋白的制备：利用相关蛋白上侧链氨基与有机小分子AzMMMan的酸酐键在碱性条件下反应，连接形成酰胺键；S2、由AzMMMan修饰后的蛋白与相关分子点击化学交联的制备：利用AzMMMan修饰后的蛋白上带有的叠氮基团与相关分子上被修饰后带有的二苯基环辛炔在弱碱性条件下发生点击化学反应，连接形成氮杂环；步骤二：利用AzMMMan化学修饰ProteinA得到ProteinA-AzM-DBCO-X；利用AzMMMan化学修饰ProteinB得到ProteinB-AzM-DBCO-Y；S1、将CAT溶解于pH9.0的HEPES缓冲溶液中，将由少量乙腈溶解的有机小分子AzMMMan缓慢滴加至改缓冲液中，室温下反应4小时得到CAT-AZ；S2、将Pt-COOH以少量二甲基亚砜为溶剂，EDC/NHS活化半小时，随后将其加入...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘小文，
申请(专利权)人：诸暨德齐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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