抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株技术

本发明专利技术公开了一种抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株。本发明专利技术针对药用辅料(聚乙二醇和表面活性剂等)会降低蛋白质药物活性和半衰期的问题，通过对来自变形假单孢菌(P.plecoglossicida)的野生型精氨酸脱亚胺酶进行分子改造(随机突变和理性设计)，优化药物蛋白PEG修饰位点和表面活性剂耐受性位点，最终获得了一种高活性、高稳定性的精氨酸脱亚胺酶突变体。实验证明，本发明专利技术最终所得的精氨酸脱亚胺酶突变体具有可观的相对储存期和半衰期，可作为候选抗癌蛋白质药物。

Molecular modification of arginine deaminase half-life and mutants

The invention discloses a molecular modification method for the half-life of arginine deaminase, an anticancer drug, and a mutant strain. The invention aims at the problem that pharmaceutical excipients (polyethylene glycol, surfactant, etc.) can reduce the drug activity and half-life of proteins. Through molecular modification (random mutation and rational design) of wild-type arginine deaminase from Pseudomonas mutans (P. plecoglossicida), the modification site of PEG and the tolerance site of surfactant for drug proteins are optimized, and a high activity is finally obtained. Sexual and highly stable arginine deaminase mutants. Experiments show that the arginine deaminase mutant obtained by the invention has considerable relative storage and half-life, and can be used as a candidate anti-cancer protein drug.

【技术实现步骤摘要】
抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株
本专利技术属于生物
，涉及抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株。
技术介绍
精氨酸脱亚胺酶(argininedeminase,ADI,EC3.5.3.6)，属于“胍基修饰酶”超家族中的一员，负责催化ADI途径中第一步反应，可将精氨酸转化为瓜氨酸和氨。早前，ADI主要应用于转化精氨酸生产瓜氨酸。近年来，ADI在抗肿瘤探索中表现日益突出而备受关注。由于其可将人体血液中的精氨酸转化为瓜氨酸和氨，使精氨酸缺陷型癌细胞因精氨酸的供给阻断而死亡，从而达到治疗癌症的目的。研究发现，ADI能比天冬酰胺酶能更有效地抵抗白血病，仅仅需5-10ng/mLADI就能抑制白血病细胞生长，比L-天冬酰胺酶的浓度低约20-100倍；并且ADI能够专一性地作用于T细胞，而不影响B细胞，可以避免天冬酰胺酶的一些副作用，比如过敏性反应和凝固作用等，因此精氨酸脱亚胺酶是一种极具潜力的可用于治疗精氨酸缺陷型肿瘤的精氨酸消耗性抗癌药物，可用于治疗肝癌、黑色素瘤、急性髓性白血病及乳腺癌等。近年来，ADI作为新型抗癌药物的临床研究在国内外已经开展并引起了高度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.优化药用蛋白的聚乙二醇修饰位点的分子改造方法，包括如下步骤(I)‑(II)：(I)按照如下(1)‑(3)所示步骤从野生型待优化药用蛋白的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点：(1)从所述野生型待优化药用蛋白的所有氨基酸残基中选出溶剂可及

【技术特征摘要】
1.优化药用蛋白的聚乙二醇修饰位点的分子改造方法，包括如下步骤(I)-(II)：(I)按照如下(1)-(3)所示步骤从野生型待优化药用蛋白的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点：(1)从所述野生型待优化药用蛋白的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点；(II)将所述野生型待优化药用蛋白中的所述聚乙二醇修饰位点处的全部或部分氨基酸突变为赖氨酸，从而完成对所述野生型待优化药用蛋白的聚乙二醇修饰位点的分子改造。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述药用蛋白为精氨酸脱亚胺酶。3.精氨酸脱亚胺酶突变体，为精氨酸脱亚胺酶突变体A或精氨酸脱亚胺酶突变体B或精氨酸脱亚胺酶突变体C；所述精氨酸脱亚胺酶突变体A为将野生型精氨酸脱亚胺酶中的聚乙二醇修饰位点和表面活性剂耐受位点处的氨基酸进行定点突变后得到的；其中，将所述聚乙二醇修饰位点处的氨基酸全部或部分突变为赖氨酸，将所述表面活性剂耐受位点处的氨基酸全部或部分突变为精氨酸或脯氨酸；所述精氨酸脱亚胺酶突变体B为将野生型精氨酸脱亚胺酶中的聚乙二醇修饰位点处的氨基酸进行定点突变后得到的，将所述聚乙二醇修饰位点处的氨基酸全部或部分突变为赖氨酸；所述精氨酸脱亚胺酶突变体C将野生型精氨酸脱亚胺酶中的表面活性剂耐受位点处的氨基酸进行定点突变后得到的；将所述表面活性剂耐受位点处的氨基酸全部或部分突变为精氨酸或脯氨酸；所述精氨酸脱亚胺酶突变体A和所述精氨酸脱亚胺酶突变体B中，所述聚乙二醇修饰位点均是按照如下(1)-(3)所示步骤从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选择出来的：(1)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点。4.权利要求3所述精氨酸脱亚胺酶突变体的制备方法，为如下方法一或方法二或方法三：方法一：权利要求3中所述精氨酸脱亚胺酶突变体A的制备方法，包括如下步骤(A1)-(A3)：(A1)按照如下(1)-(3)所示步骤从野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点：(1)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点；(A2)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出表面活性剂耐受位点；(A3)将所述野生型精氨酸脱亚胺酶中的所述聚乙二醇修饰位点和所述表面活性剂耐受位点处的氨基酸进行定点突变，得到所述精氨酸脱亚胺酶突变体A；其中，所述聚乙二醇修饰位点处的突变为将所述聚乙二醇修饰位点中的全部或部分突变为赖氨酸，所述表面活性剂耐受位点处的突变为将所述表面活性剂耐受位点中的全部或部分突变为精氨酸或脯氨酸；方法二：权利要求3中所述精氨酸脱亚胺酶突变体B的制备方法，包括如下步骤(B1)-(B2)：(B1)按照如下(1)-(3)所示步骤从野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点：(1)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱蕾蕾，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12