本发明专利技术公开了一种L‑氨基酸脱氨酶的突变体及其制备方法与应用，属于基因工程领域。本发明专利技术的L‑氨基酸脱氨酶的突变体T436A包括一个位于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)来源的L‑氨基酸脱氨酶Loops上相应氨基酸残基位点的取代，突变体T436A对L‑亮氨酸的催化效率比原L‑氨基酸脱氨酶提高了72.7％，每升转化液中含有106.2g/Lα‑酮异己酸。L‑亮氨酸的摩尔转化率达到97.7％。
A mutant of L- amino acid deaminase and its preparation and Application
The invention discloses a mutant of L_amino acid deaminase and a preparation method and application thereof, belonging to the field of genetic engineering. The mutant T436A of the present invention consists of a substitution of a corresponding amino acid residue site on the L_amino acid deaminase Loops from Proteus mirabilis. The catalytic efficiency of the mutant T436A for L-leucine is 72.7% higher than that of the original L-amino acid deaminase, and contains an amino acid residue per liter of the conversion fluid. 106.2g/L alpha ketone ISO caproic acid. The molar conversion of L leucine reached 97.7%.
【技术实现步骤摘要】
一种L-氨基酸脱氨酶的突变体及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种L-氨基酸脱氨酶的突变体及其制备方法与应用，属于基因工程领域。
技术介绍
L-氨基酸脱氨酶是一种能够催化L-氨基酸生成α-酮酸的氧化还原酶。一直以来，有着大量对其研究与报道，大多数关于该酶的三维结构、底物特异性。近年来，有关利用该酶生物转化生产α-酮酸逐渐引起研究人员的注意，拥有着广泛的应用前景。由于该酶定位在细胞膜当中，酶与细胞膜上的电子传递链相关，在转化L-氨基酸生成α-酮酸的过程中，电子经过电子传递链传递给细胞色素氧化酶，使分子氧还原为水，过程不产生过氧化氢，有利于转化保持在一个温和的环境下持续进行，这为异源表达氨基酸脱氨酶转化L-亮氨酸生产α-酮异己酸提供了可能。然而目前利用该酶转化生产α-酮异己酸的产量和转化率都较低，还不能够达到工业化生产的要求，因需要进一步提高α-酮异己酸的产量和转化率。先前有关研究团队开发的一种RBS优化提高α-酮异己酸产量的方法，虽然能够提高α-酮异己酸的产量，但转化率太低(刘龙，陈坚，堵国成，李江华，宋阳.一种RBS优化提高α-酮异己酸产量的方法.申请号201510575189.1)。因此，为提高α-酮异己酸的产量和转化率，增强其工业应用价值，急需提高L-氨基酸脱氨酶对L-亮氨酸的催化效率。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种L-氨基酸脱氨酶的突变体，含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。本专利技术的第二个目的是提供一种编码所述L-氨基酸脱氨酶的突变体的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因含有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术的第三个目的是提供一种提高L-氨基酸脱氨酶对L-亮氨酸的催化效率的方法，所述方法是将奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)来源的L-氨基酸脱氨酶的第436位的氨基酸苏氨酸Thr突变成丙氨酸Ala。在本专利技术的一种实施方式中，所述奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)来源的L-氨基酸脱氨酶的Genbank登录号为AAA8675，含有474个氨基酸。本专利技术的第四个目的是提供一种构建所述突变体的方法，是在奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)L-氨基酸脱氨酶同源建模的基础上，通过结构分析确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带L-氨基酸脱氨酶基因的pET20b载体为模板进行定点突变构建突变质粒T436A-pET20b，将突变后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后得到阳性单克隆T436A。本专利技术的第五个目的是提供一种提高α-酮异己酸产量的方法，是利用所述的L-氨基酸脱氨酶突变体菌株作为全细胞催化剂，转化含L-亮氨酸的底物得到α-酮异己酸。本专利技术的一种实施方式中，将含有20～25g/L全细胞、100～120g/L底物的体系在30～35℃反应18～22h生成α-酮异己酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化在20mM的Tris缓冲液中进行。本专利技术的一种实施方式中，所突变体菌株全细胞的按如下方式收集获得：将种子培养液按照2％的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8，添加终浓度为0.4mM的IPTG，25℃诱导12h，收集细胞。本专利技术的一种实施方式中，用于培养菌株的种子培养基每升含有：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容。本专利技术的一种实施方式中，用于发酵的发酵培养基每升含有：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，磷酸二氢钾2.31g，磷酸氢二钾16.42g。本专利技术还要求保护所述突变体在发酵生产中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种具有高效催化L-亮氨酸生产α-酮异己酸的L-氨基酸脱氨酶突变体及其制备办法与应用。突变体T436A对L-亮氨酸的催化效率比原L-氨基酸脱氨酶提高了72.7％，α-酮异己酸的产量达到106.2g/L，底物摩尔转化率为97.7％。本转化方法较化学法相比，具有反应条件温和，目标产物单一，易于分离，对环境友好等优势，且工艺简单，便于控制，易于推广应用。附图说明图1奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)L-氨基酸脱氨酶突变体纯化SDS-PAGE电泳图；泳道1：标准分子量蛋白；泳道2：空白对照；泳道3:T436A纯化制品。图2奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)L-氨基酸脱氨酶突变体催化生成α-酮异己酸产量。□：出发酶wt；■：突变体T436A。具体实施方式LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容到1L。发酵培养基：(TB培养基)：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，磷酸二氢钾2.31g，磷酸氢二钾16.42g，蒸馏水定容到1L。样品制备：取1mL转化后的转化溶液，在12,000rpm下离心5min，取上清液稀释后，经过0.45μm滤膜过滤，过滤液供液相色谱分析。α-酮异己酸的含量测定：戴安高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)，采用伯乐AminexHPX-87H(300×7.8mm，9μm)色谱柱，流动相为浓度2.5mmol/L的稀硫酸，流动相经0.22μm滤膜过滤，超声脱气，流速为0.6mL/min，柱温为40℃，在紫外检测波长205nm下检测。实施例1奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)L-氨基酸脱氨酶突变体的制备方法以连接有奇异变形杆菌L-氨基酸脱氨酶编码基因pma(基因序列SEQIDNO.3所示)的pET20b质粒(简写为pma-pET20b)为模板，利用T436A的突变引物通过一次PCR得到大小为1422bp左右的产物，将PCR产物通过DpnⅠ处理后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑选转化子测序验证。突变引物如下所示(方框为突变位点)：T436A突变引物对：上述PCR体系均为：上述PCR条件均为：95℃预变性3min，95℃变性3min然后进入以下循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1min40s；34个循环；72℃延伸10min，4℃保温。测序结果表明除了所需要的突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒T436A-pET20b构建成功。实施例2：奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)L-氨基酸脱氨酶突变体的表达纯化方法。将突变体T436A-pET20b转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选转化子进行测序验证。将验证后的阳性转化子在LB培养基中37℃培养过夜，后接入TB发酵培养基37℃培养至3h左右用终浓度为0.4mM的IPTG诱导，降温至25℃培养12h。收集发酵液，4℃，8000rpm离心20min收集菌体。将收集的细胞在洗涤液中超声，洗涤液组分：500mMNaCI，20mMTrispH8.0，0.05％w/vTritonX-100，20mM咪唑。细胞裂解物16，000g离心30min，上清液过0.45μm膜后加到载到用洗涤液预平衡的镍螯合柱上，然后再用20倍柱体积的洗涤液洗涤柱子除去杂质，然后用30mL洗脱液洗脱目标蛋白，洗脱液组分：500mMNaCI，20mMTrispH8.0，500mM咪唑。然后再将洗脱后的蛋白用脱盐柱进一步纯化，再用30KDa的超滤管离心浓缩，得纯化的L-氨基酸脱氨酶突变体。纯化结果如图1所示，纯化后L-氨基酸突变体达到本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种L‑氨基酸脱氨酶的突变体，其特征在于，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种L-氨基酸脱氨酶的突变体，其特征在于，含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.一种编码权利要求1所述L-氨基酸脱氨酶的突变体的基因。3.一种提高L-氨基酸脱氨酶对L-亮氨酸的催化效率的方法，其特征在于，将奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)来源的L-氨基酸脱氨酶的第436位的氨基酸苏氨酸突变成丙氨酸。4.一种构建权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，在奇异变形杆菌L-氨基酸脱氨酶同源建模的基础上，通过结构分析确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带L-氨基酸脱氨酶基因的pET20b载体为模板进行定点突变构建突变质粒T436A-pET20b，将突变后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后得到阳性单克隆突变体T436A。5.一种基因工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述的L-氨基酸脱氨酶的突变体。6.一种提高α-酮异己酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，袁宇翔，陈修来，刘佳，罗秋玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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