本发明专利技术提供一种用于哺乳动物细胞蛋白(尤其是抗体)筛选、工程化改造/进化的AID酶突变体及其应用。本发明专利技术提供的AID酶突变体在CHO细胞中的突变能力显著增强，相对于野生型AID能够提供数量更多、突变类型更丰富的抗体突变体，并且不影响CHO细胞的存活率，有利于快速高效的构建抗体突变库和加速抗体亲和力成熟。
【技术实现步骤摘要】
一种AID酶突变体及其应用
本专利技术属于基因工程、生物工程领域，具体涉及一种AID酶突变体及其应用。
技术介绍
过去20多年中，蛋白、多肽、抗体药物的开发和临床治疗应用取得了长足进展。驱动治疗性抗体、蛋白发展的关键技术之一是抗体的亲和力成熟。目前用于抗体筛选和亲和力优化的技术有核糖体展示、噬菌体展示、酵母展示、细菌展示以及哺乳动物细胞展示。噬菌体展示、细菌展示和酵母展示系统进行抗体进化的基本流程均为：1)利用易错PCR、DNA改组、交错延伸、随机体外重组等方法获得抗体突变，2)通过酶切、连接构建抗体质粒库，转染相应的细菌或者酵母细胞，展示抗体，3)筛选出具有优良性状的抗体突变体。但是以上展示技术是以非细胞(噬菌体)或者微生物细胞(细菌、酵母)为平台建立的，在抗体蛋白的表达、折叠及修饰(如糖基化、甲基化等)等方面与动物细胞仍然具有明显的差别，在药用过程中常常会导致人体产生针对抗体的免疫反应，从而影响抗体的应用及药效。由于哺乳动物细胞展示技术筛选的抗体在结构和修饰方面更接近于人体自身的抗体，故该技术近年来受到了越来越多的关注。基于近年来体细胞高频突变的理论研究成果，人们发现在B细胞的成熟过程中，激活诱导的胞嘧啶脱氨基酶(AID)诱导胞嘧啶脱氨基产生尿嘧啶使抗体基因发生高频突变,从而为改变抗体的特异性和亲和力提供了基础。因此，现阶段的哺乳动物细胞抗体进化平台将动物细胞抗体展示技术与体细胞高频突变(SHM)联系起来，模拟体内亲和力成熟过程，进行抗体亲和力成熟。这类抗体进化平台主要包括三部分：1)选择或者建立具有突变能力的细胞，2)将抗体稳定的展示在突变细胞表面，3)流式分选或者磁珠筛选富集优良的抗体突变体。该平台不仅能够用于筛选抗体，还能够应用于多肽或蛋白的进化，使其稳定性增加，或使多肽、蛋白与配体的亲和力得到提升，可应用于多肽或蛋白类药物的研发。国内外的一些研究小组已经根据AID致突变作用在哺乳动物细胞中建立了各自的抗体亲和力成熟系统，并且成功的在体外对一些抗体进行了亲和力成熟优化。然而这些系统都存在以下缺陷：1)细胞突变效率不高，导致库容量相对偏小；效率低包括以下两个原因：a.AID除了突变抗体基因也能突变别的细胞基因，细胞不能耐受太高水平的AID；b.AID也能突变AID自身，多轮扩增后，有的细胞会丢失AID活性；2)获得稳定的展示目标抗体的细胞相对困难，亲和力成熟所需时间长。在本课题组之前的工作中，筛选出一株稳定且高表达目的基因的CHO细胞(参见专利ZL201410803422.2)，对抗体亲和力成熟进化筛选效率较高，能够在较短的时间和筛选轮次内将抗体亲和力大幅度提高。参考文献：1.MartinA,etal.SomatichypermutationoftheAIDtransgeneinBandnon-Bcells.ProcNatlAcadSciUSA99:12304–12308.2.ChuanChen,etal.Couplingrecombinase-mediatedcassetteexchangewithsomatichypermutationforantibodyaffinitymaturationinCHOcells.Biotechnology&Bioengineering,2016,113(1):39-51.3.MengWang，etal.AIDup-mutantsisolatedusingahigh-throughputscreenhighlighttheimmunity/cancerbalancelimitingDNAdeaminaseactivity.NatStructMolBiol.2009July,16(7):769–776.4.Ito,S.,etal.Activation-inducedcytidinedeaminaseshuttlesbetweennucleusandcytoplasmlikeapolipoproteinBmRNAeditingcatalyticpolypeptide1.ProcNatlAcadSciUSA,2004.101(7):p.1975-1980.5.Gajula,K.S.,etal.High-throughputmutagenesisrevealsfunctionaldeterminantsforDNAtargetingbyactivation-induceddeaminase.NucleicAcidsResearch,2014.42(15):p.9964-9975.6.WangCL,etal.Genome-widesomatichypermutation[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2004,101(19):7352-7356.7.YoshikawaK,etal.AIDEnzyme-InducedHypermutationinanActivelyTranscribedGeneinFibroblasts.Science,2002,296(5575):2033.8.ChenS,etal.Affinitymaturationofanti-TNF-alphascFvwithsomatichypermutationinnon-Bcells.Protein&Cell,2012,3(6):460-469.
技术实现思路
针对上述现有技术存在的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是：如何提高哺乳动物细胞突变效率，尽可能提供多样化的抗体突变体/变异体，且在此基础上不影响哺乳动物细胞的生存和扩增能力。本专利技术深入研究AID和抗体基因对抗体库产生效率的影响，构建具有更高突变效率的AID酶突变体。有报道，如果去掉AID酶C端的核输出信号(NES)，AID酶可在细胞核中聚集，突变能力也会增加。此外，人们在大肠杆菌中筛选了具有更高催化活性的AID酶突变体(T82I，K10E/E156G/T82I，R119G和D118A/R119G/K120R/A121R)。这些AID酶突变体能否在CHO细胞中发挥作用，提高抗体基因库多样性产生效率，值得深入研究。本专利技术中，我们构建了AID酶突变体，将其应用到本课题组现有的CHO细胞抗体进化平台，检测以上突变及突变组合是否具有更高的突变效率。为实现本专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供了一种AID酶突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.5、9或11所示。本专利技术还提供了一种AID酶突变体的编码基因，其能够编码产生SEQIDNO.5、9或11所示氨基酸序列；优选的，所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.6、10或12所示。本专利技术提供了一种包含AID酶突变体的载体，所述载体包含编码SEQIDNO.5、9或11所示氨基酸序列的核苷酸序列。优选的，上述载体包含SEQIDNO.6、10或12所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种细菌或非人哺乳动物细胞，所述细胞包含具有SEQIDNO.5、9或11所示氨基酸序列的AID酶突变体；所述非人哺乳动物细胞优选CHO细胞。本专利技术提供了一种AID酶突变体、其编码核酸、包含其编码核酸的载体、细菌或细胞在蛋白或多肽筛选、抗体亲和力成熟、抗体工本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种激活诱导的胞嘧啶脱氨基酶(AID)突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5、9或11所示。
【技术特征摘要】
1.一种激活诱导的胞嘧啶脱氨基酶(AID)突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.5、9或11所示。2.一种AID酶突变体的编码核酸，其特征在于，所示核酸能够编码产生SEQIDNO.5、9或11所示氨基酸序列；优选的，所述编码核酸的核苷酸序列为SEQIDNO.6、10或12所示。3.一种包含AID酶突变体编码核酸的载体，其特征在于，所述载体包含编码SEQIDNO.5、9或11所示氨基酸序列的核苷酸序列；优选的，上述载体包含SEQIDNO.6、10或12所示的核苷酸序列。4.一种细菌或非人哺乳动物细胞，其特征在于，所述细菌或细胞包含具有SEQIDNO.5、9或11所示氨基酸序列的AID酶突变体；所述非人哺乳动物细胞优选CHO。5.权利要求1所述AID酶突变体、权利要求2所述核酸、权利要求3所述载体和/或权利要求4所述细菌或细胞在蛋白筛选、抗体亲和力成熟、抗体工程化改造、抗体库建立和/或抗体筛选中的应用，优选的，上述蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：杭海英，罗蕊琪，赵云，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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