本发明专利技术公开了一种泛生菌酰胺酶、基因、载体、工程菌及其在生物催化1‑氰基环己基乙酰胺制备1‑氰基环己基乙酸中的应用，所述酰胺酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；本发明专利技术首次报道了利用酰胺酶生物催化生成1‑氰基环己基乙酸的合成工艺，具有催化剂用量小(2g/L)，底物浓度高(100g/L)，反应时间短(20min)，产物转化率达100％等显著优势。
An Amidase, Gene, Vector, Engineering Bacteria of Panbiotic Bacteria and Its Application
The invention discloses a panbiotic amidase, gene, carrier, engineering bacteria and its application in biocatalysis of 1 cyanocyclohexylacetamide to prepare 1 cyanocyclohexylacetic acid. The amino acid sequence of the amidase is shown in SEQ ID NO.1. The synthesis process of 1 cyanocyclohexylacetic acid by biocatalysis of amidase is reported for the first time, and the amount of catalyst is small. (2g/L), high substrate concentration (100g/L), short reaction time (20min), and 100% conversion of products have obvious advantages.
【技术实现步骤摘要】
一种泛生菌酰胺酶、基因、载体、工程菌及其应用(一)
本专利技术涉及一种编码酰胺酶的基因、编码酶蛋白、含有该基因的重组载体以及转化得到的重组基因工程菌及其在催化1-氰基环己基乙酰胺合成加巴喷丁关键中间体1-氰基环己基乙酸中的应用。(二)
技术介绍
加巴喷丁，化学名为1-(氨甲基)环己基乙酸(I)，是由美国Warner-Lambert公司开发的癫痫治疗药物，其后又被用于神经病理性疼痛的治疗。与当前同类药物相比，加巴喷丁在口服吸收、毒副作用、耐受性以及治疗效果等方面具有优势显著。而且加巴喷丁在体内不易代谢，不诱导产生肝酶，与其它抗癫痫药物极少相互作用。因此，加巴喷丁在癫痫治疗药物市场中占有重要地位。尽管加巴喷丁分子结构相对简单，但其为两性分子(既有-NH2又有-COOH)，极易形成五元环内酯。目前，已报道的加巴喷丁合成路线一般以环己酮为起始原料，经全化学法合成(US2003009055A,DE2543821,EP4l4262A)。如环己酮经环合、水解、缩合、氨解和Hoffmann降解等步骤得到加巴喷丁(WO2003002504，WO2003002517)。但该工艺会产生大量酸性废液，且产物需用离子交换分离，成本较高。此外，以非环己酮的六元环化合物如苯甲腈为起始原料的工艺，由于原料价格高，反应条件苛刻，工业化开发价值低。区域选择性水解脂环族α,ω-二腈化合物1-氰基环己基乙腈(Ⅱ)可获得加巴喷丁关键中间体1-氰基环己基乙酸(Ⅲ)，该中间体经一步催化加氢即得到终产品。该路线是目前最为简便、绿色的加巴喷丁合成工艺之一(US20050009154)。但该催化工艺底物浓度低，反应时间长，2.96g/L底物经22h催化，转化率为97％。此外，专利CN201410053739.9报道了红球菌ZJB1208腈水合酶区域选择性催化1-氰基环己基乙腈合成1-氰基环己基乙酰胺(Ⅳ)的工艺。但在化学水解1-氰基环己基乙酰胺合成1-氰基环己基乙酸时，该分子中的氰基和酰胺基团易同时被水解。因此，酰胺酶催化水解1-氰基环己基乙酰胺成为合成1-氰基环己基乙酸的首选方法。酰胺酶(Amidase,EC3.5.1.4)是一类可催化各类天然、非天然酰胺类化合物水解生成相应羧酸的水解酶。由于具有良好的化学、区域和立体选择性，以及宽广的底物谱，酰胺酶在医药化工行业的应用前景广阔。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种酰胺酶基因、含有该酰胺酶基因的重组载体、该重组载体转化得到的基因工程菌和表达得到的重组酰胺酶，及其在催化1-氰基环己基乙酰胺水解合成1-氰基环己基乙酸中的应用，为腈水合酶/酰胺酶耦联催化合成加巴喷丁关键中间体奠定基础，解决目前腈水解酶选择性水解路线所存在的催化剂用量过大，反应时间过长等问题。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种泛生菌酰胺酶，所述酰胺酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。任何对SEQIDNO.1所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有酰胺酶活性的，仍属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供一种所述泛生菌酰胺酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。该酰胺酶基因通过分子生物学手段人工合成，具体的筛选方法为根据酰胺酶标签(Amidasesignature，AS)家族及腈水解酶(Nitrilasesuperfamily,NF)家族酰胺酶保守序列针对性地寻找NCBI收录的氨基酸序列，进一步筛选可匹配催化三联体的蛋白。最终确定了一个酰胺酶(GenBankaccessionNO.WP_008109374)，该酰胺酶来源于泛生菌(Pantoeasp.YR343)，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。依据该氨基酸序列推测编码该酰胺酶的基因，并根据大肠杆菌偏好的密码子对该基因进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了该段酰胺酶基因pa-ami，为方便重组酰胺酶的分离纯化，在该基因末端加入表达组氨酸标签的核苷酸序列，全长1445bp，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。如本领域技术人员所知，本专利技术的酰胺酶基因核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的其它任何核苷酸序列。任何对SEQIDNO.2所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还涉及一种由所述泛生菌酰胺酶编码基因构建的重组载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本专利技术的泛生菌酰胺酶核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28a。较佳地，可通过下述方法获得本专利技术的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的酰胺酶基因产物pa-ami与载体pUC57连接形成克隆载体。该克隆载体经限制性内切酶NcoI/HindⅢ双酶切，切胶回收后与同样经酶切处理回收的pET-28a连接，构建本专利技术的酰胺酶基因重组表达质粒pET28a-Pa-Ami。本专利技术还涉及一种由所述重组载体转化获得的重组基因工程菌，可通过将本专利技术的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本专利技术的酰胺酶基因可以有效表达。本专利技术优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。将重组质粒pET28a-Pa-Ami转化至E.coliBL21(DE3)中，获得工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami。本专利技术还涉及一种所述泛生菌酰胺酶编码基因在制备泛生菌酰胺酶中的应用，所述的应用为：构建含泛生菌酰胺酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化，获得含泛生菌酰胺酶的菌体细胞。所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本专利技术的泛生菌酰胺酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生酰胺酶即可。优选下述方法：将本专利技术涉及的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本专利技术的重组酰胺酶，具体为：将构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-Pa-Ami接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种到含50μg/mL卡那霉素LB培养基中，37℃，150rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃，8000rpm离心10min，收集湿菌体。此外，本专利技术提供一种所述泛生菌酰胺酶在生物催化1-氰基环己基乙酰胺制备1-氰基环己基乙酸中的应用，具体所述的应用为：以含泛生菌酰胺酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以1-氰基环己基乙酰胺为底物，以pH6本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种泛生菌酰胺酶在生物催化1‑氰基环己基乙酰胺制备1‑氰基环己基乙酸中的应用，其特征在于所述酰胺酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种泛生菌酰胺酶在生物催化1-氰基环己基乙酰胺制备1-氰基环己基乙酸中的应用，其特征在于所述酰胺酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述泛生菌酰胺酶编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含泛生菌酰胺酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以1-氰基环己基乙酰胺为底物，以pH6～10的缓...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑仁朝，郑裕国，吴哲明，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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