一种生物法制备苯乙酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种生物法制备苯乙酸的方法，其包括如下步骤：将苯乙腈分为若干批次，每批次的体积相等，每隔一定时间将一批次苯乙腈加入转化液中，然后在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应，待上一批次的苯乙腈的转化率达到一定程度后再加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的转化率达到一定程度后终止反应，得到苯乙酸；该转化液中包括含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌；本发明专利技术由于采用了MG腈水解酶和分批次加入苯乙腈相结合的方法制备苯乙酸，不仅工艺路线简单、反应条件温和以及没有污染，而且苯乙酸的积累浓度高达1M，具有良好的工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种生物法制备苯乙酸的方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种生物法制备苯乙酸的方法。
技术介绍
苯乙酸是一种重要的有机化合物，由于其具有羧基、亚甲基氢和苯环的典型反应，可以生成多种中间体，因此在医药、香料、农药等行业应用广泛，尤其是在青霉素工业盐的生产上具有巨大的需求量。目前，苯乙酸的合成路线多达数十种，其中常见的有：氰化钠法、苯乙烯法、苯乙酮法以及苄基卤化物羰化法。国内苯乙酸的生产主要采用氰化钠法，该方法主要分为两步，首先由氯苄和氰化钠合成苯乙腈，随后通过酸碱水解法将苯乙腈转化为苯乙酸。然而，在苯乙腈水解生产为苯乙酸的过程中，由于需要强酸强碱的参与以及持续保持高温的过程，能耗较高。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种生物法制备苯乙酸的方法，该方法的反应条件温和、能耗低并且原料苯乙腈的转化率较高。为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：一种生物法制备苯乙酸的方法，其包括如下步骤：将苯乙腈分批次加入转化液中，在转化pH为6.0‐9.0和转化温度为20‐40℃的条件下反应5‐20个批次，待上一批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后终止反应，得到苯乙酸；其中，苯乙腈所分批次的数目可以为7‐15，优选为8‐12。下一批次的苯乙腈的添加时间为：待上一批次的苯乙腈的转化率达到80％‐95％后加入下一批次，优选为85％‐90％。转化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌。该转化液的制备方法包括如下步骤：(1)、将E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心以得到静息细胞；(2)、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液。每批次所加入的苯乙腈的量可以相等，为0.1‐20mL/g静息细胞，也可以为0.3‐10mL/g静息细胞，还可以为0.5‐1mL/g静息细胞。在步骤(1)中，发酵培养基的组分及含量如下：酵母膏16‐60gL‐1、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。在步骤(2)中的转化液中，静息细胞的浓度大于10gL‐1，优选为10‐100gL‐1，更优选为10‐50gL‐1，最优选为10‐20gL‐1。步骤(2)中的缓冲液为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液中和Tris‐HCl缓冲液的任意一种。步骤(2)中还添加了苯乙腈的助溶剂，助溶剂为体积分数为1％‐25％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种；步骤(2)中的缓冲液的浓度可以为20‐200mM。助溶剂的体积分数可以为5％‐10％。转化pH可以为7‐9，优选为7‐8.5，更优选为7.95‐8.10。转化温度可以为25‐37℃，优选为30℃。由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用生物法来制备苯乙酸，其先将苯乙腈分为若干体积相等的批次，每隔一定时间将一批次苯乙腈加入转化液中(每批次所加入的苯乙腈的量也相等)，然后在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应，待上一批次的苯乙腈的转化率达到一定程度后再加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的转化率达到一定程度后终止反应，得到苯乙酸。由上述可知，本专利技术的方法以苯乙腈为起始原料，利用高密度发酵获得的静息细胞(用于分泌MG腈水解酶)为生物催化剂，并采用具有较高水解活性的MG腈水解酶和苯乙腈的分批次加入工艺相结合来生产苯乙酸，不仅工艺路线简单、反应条件温和以及没有污染，而且能够通过不断控制苯乙腈的加入量来实现苯乙酸的高浓度积累，使单批次反应苯乙酸积累浓度高达1M，苯乙腈的转化率大于99％，从而具有良好的工业化应用前景。另外，本专利技术的方法成本低廉，能耗也较低。总之，相对于现有技术而言，由MG腈水解酶介导的苯乙腈水解为苯乙酸的过程反应所需条件温和，能够有效地降低能耗，对环境友好，成为苯乙酸生产的一条有效取代途径。附图说明图1为本专利技术的静息细胞催化水解苯乙腈制备苯乙酸反应进程曲线图。具体实施方式本专利技术公开了一种生物法制备苯乙酸的方法，该方法包括如下步骤：(1)、将用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心以得到静息细胞；(2)、收集步骤(1)所得的静息细胞，将该静息细胞悬浮于pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液，故该转化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌；(3)、将苯乙腈分批次加入转化液中，在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应5‐20个批次，待上一批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后终止反应，得到苯乙酸。其中，在步骤(1)中，MG腈水解酶是由BCJ2315腈水解酶突变而来的，BCJ2315腈水解酶来自BurkholderiacenocepaciaJ2315。用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌详见Wang等人在AppliedandEnvironmentMicrobiology,2015,81:24公开的非专利文献《ProteinEngineeringofaNitrilasefromBurkholderiacenocepaciaJ2315forEfficientandEnantioselectiveProductionof(R)‐ο‐ChloromandelicAcid》的记载。步骤(1)中的发酵培养基含有以下组分并且每种组分的含量(如表1所示)如下：酵母膏16‐60g/L、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。在步骤(1)中，还可以根据实际情况添加发酵补料培养基(如表2所示)。在步骤(2)所得的转化液中，静息细胞的浓度应大于10gL‐1，优选为10‐100gL‐1，更优选为10‐50gL‐1，最优选为10‐20gL‐1。催化反应所需的MG腈水解酶是通过静息细胞分泌的，所以静息细胞的浓度影响的是MG腈水解酶的浓度。而MG腈水解酶的浓度越高则相对的催化效率越高，即单位时间内苯乙腈的转化量越高。步骤(2)中的缓冲液为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液中、Tris‐HCl缓冲液或其他任何常用pH缓冲液中的任意一种。步骤(2)中除了添加缓冲液外，还可以添加苯乙腈的助溶剂，助溶剂为体积分数为1％‐25％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种。该缓冲液的浓度可以为20‐200mM，助溶剂的添加量可以为5％‐10％(v/v)。在步骤(3)中，每批次的苯乙腈的反应条件均相同，均在转化pH为6.0‐9.0和转化温度为20‐40℃的条件下反应。当前一个批次的反应结束后，要重新检测pH值和温度并判断其是否在上述范围内，若不在，则需要将反应条件重新调整为初始反应条件，即pH为6.0‐9.0中的任意一个数值和温度为20‐40℃中的任意一个数值。例如，对转化时pH的调节可以采用氨水、NaOH溶液或者Na2CO3溶液进行。其中，氨水的浓度可以为1M到纯氨水，优选为2‐10M，更优选为4‐8M，最优选为6M。转化时p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物法制备苯乙酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：将苯乙腈分批次加入转化液中，在转化pH为6.0‐9.0和转化温度为20‐40℃的条件下反应5‐20个批次，待上一批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后终止反应，得到苯乙酸；所述的转化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种生物法制备苯乙酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：将苯乙腈分批次加入转化液中，在转化pH为6.0‐9.0和转化温度为20‐40℃的条件下反应5‐20个批次，待上一批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后终止反应，得到苯乙酸；所述的转化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述批次的数目为7‐15；和/或，待上一批次的苯乙腈的转化率达到80％‐95％后加入下一批次；优选地，所述批次的数目为8‐12；和/或，待上一批次的苯乙腈的转化率达到85％‐90％后加入下一批次。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的转化液的制备方法包括如下步骤：(1)、将所述的E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心以得到静息细胞；(2)、收集所述的静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到所述的转化液；优选地，每批次所加入的苯乙腈的量相等，为0.1‐20mL/g静息细胞；更优选地，每批次所加入的苯乙腈的量为0.3‐10mL/g静息细胞；最优选地，每批次所加入的苯乙腈的量为0.5‐1mL/g静息细胞。...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏东芝，许向阳，宋在伟，王华磊，
申请(专利权)人：枣庄市杰诺生物酶有限公司，华东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37