检测人类免疫缺陷病毒核酸的引物、探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的引物、探针、试剂盒及检测方法。所述检测人类免疫缺陷病毒核酸的引物包括：第一引物对，其包括第一引物和第二引物，其序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；第二引物对，其包括第三引物和第四引物，其序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。所述探针对包括第一探针和第二探针，其序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。所述试剂盒包括引物组和探针对。所述检测方法包括：利用试剂盒，对液滴生成液包裹的检测的人类免疫缺陷病毒核酸样本与PCR反应液形成的液滴进行PCR扩增。本发明专利技术的试剂盒检测下限低，灵敏度高，特异性好，检测方法效率高。

Primers, Probes, Kits and Detection Methods for Detecting Human Immunodeficiency Virus Nucleic Acid

The invention discloses a primer, a probe, a kit and a detection method for detecting human immunodeficiency virus nucleic acid. The primers for detecting human immunodeficiency virus nucleic acid include: the first primer pair, including the first primer pair and the second primer pair, whose sequence is shown as SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2 respectively; the second primer pair, including the third primer pair and the fourth primer pair, whose sequence is shown as SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4 respectively. The probe pair includes the first probe and the second probe, and the sequence of the probe pair is shown as SEQ ID NO.5 and SEQ ID NO.6, respectively. The kit comprises a primer group and a probe pair. The detection method includes: using a kit, the detection of human immunodeficiency virus nucleic acid sample wrapped in the droplet formation liquid and the droplet formed by the PCR reaction liquid are amplified by PCR. The kit has low detection limit, high sensitivity, good specificity and high detection efficiency.

【技术实现步骤摘要】
检测人类免疫缺陷病毒核酸的引物、探针、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及分子生物学
，更具体地，涉及用于RNA
，特别是指一种高灵敏检测人类免疫缺陷病毒核酸(HIV)的引物、探针及相应试剂盒，以及利用该试剂盒检测人类免疫缺陷病毒的方法。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)属于反转录病毒科，慢病毒属。HIV通过侵犯、破坏CD4+T淋巴细胞，从而导致机体免疫细胞和功能受损，最终并发各种严重的机会感染和肿瘤，是一种传播迅速、发病缓慢、死亡率高的传染性疾病。根据世界卫生组织的统计，当今全球约有3500万人携带HIV病毒，仅2016年一年就有100万人死于AIDS。HIV可以通过性、母婴以及血液等途径传播，在感染后具有6-8年的无症状期。在此期间虽无明显临床表现，但病毒在患者体内复制并破坏着患者的免疫系统，直到最终并发多种传染病乃至肿瘤。通过检测HIV-RNA可以早期诊断、了解病情进展、提供抗病毒依据、评估治疗效果、指导治疗方案的调整。目前，HIV的常用检测方法包括病毒蛋白抗体检测、抗原检测、核酸检测等方法。病毒抗原抗体检测法常选用酶联免疫吸附试验(ELISA)，即将特异性抗原或抗体吸附于固相载体上，使其与待测样品中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅推算待测抗原或抗体的含量。但刚进入机体的病毒含量很低，病毒自身抗原含量往往低于ELISA法的检测下限，并且机体需要经过一段时间才会产生抗体，在此期间血液抗体检测呈阴性，抗原抗体通常是在感染后3-6周后才能被检测出来。近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术已经在各实验室普及，尤其的荧光定量PCR技术，不仅有良好的特异性，还可以通过将病毒核酸扩增提高检测的灵敏度，缩短病毒检测的窗口期。目前国内外已有多种基于荧光定量PCR技术的病毒检测试剂盒，但是国内的检测试剂盒定量检测下限较高，灵敏度较差。而国外进口的高灵敏诊断试剂盒价格过于昂贵，提高了医疗卫生成本。因此，目前迫切需要开发一种检测下限低，灵敏度高的检测人类免疫缺陷病毒核酸的试剂盒及检测方法，以满足临床用药和检测诊断的要求。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是针对以上现状，提供一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的引物、探针，以克服现有技术中的不足。本专利技术的另一主要目的在于提供一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的试剂盒。本专利技术的另一目的还在于提供前述试剂盒在检测人类免疫缺陷病毒核酸中的用途。本专利技术的另一目的还在于提供一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的新方法。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的引物组，其包括：第一引物对，其包括第一引物和第二引物，其序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示；第二引物对，其包括第三引物和第四引物，其序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。本专利技术实施例还提供了一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的探针对，其包括：第一探针，其序列如SEQIDNO.5所示；第二探针，其序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术实施例还提供了一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的试剂盒，其包括至少一套引物组和至少一组探针对，其中一套引物组包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对包括第一引物和第二引物，其序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示，所述第二引物对包括第三引物和第四引物，其序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示，其中一组探针对为前述的探针对。本专利技术实施例还提供了前述的试剂盒于制备检测人类免疫缺陷病毒核酸的产品中的用途。进一步地，应用所述产品检测人类免疫缺陷病毒的方法包括：提供待检测的人类免疫缺陷病毒核酸样本；采用样品处理装置，使所述待检测的核酸样本与PCR反应液混合，并使形成的混合液被液滴生成液包裹，形成包含单个核酸或者不包含核酸的液滴；利用所述试剂盒所包含的引物组与探针对对所述液滴进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行检测。本专利技术实施例还提供了一种包含前述试剂盒的产品，所述产品应用于人类免疫缺陷病毒核酸的检测方法，所述检测方法包括：提供待检测的人类免疫缺陷病毒核酸样本；采用样品处理装置，使所述待检测的核酸样本与PCR反应液混合，并使形成的混合液被液滴生成液包裹，形成包含单个核酸或者不包含核酸的液滴；利用所述试剂盒所包含的引物组与探针对对所述液滴进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行检测。与现有技术相比，本专利技术的优点包括：1)本专利技术提供的高灵敏检测人类免疫缺陷病毒核酸的方法，检测结果的灵敏度及特异度更高，并可有效降低检测成本；2)本专利技术利用离心力使得核酸溶液与PCR反应液在流道中被包裹于液滴生成液中，形成单分子PCR反应体系，增加了检测的灵敏度，降低了检测下限，有利于尽早发现病毒感染；3)在本专利技术中，由于经过处理后的液滴中仅包含单分子核酸模板，在扩增时受到的干扰减少，可以避免产生不确定的结果，提高反应特异性；4)与其他仅能检测部分常见人类免疫缺陷病毒亚型核酸的试剂盒不同，本专利技术提供的试剂盒通过优化引物设计，保证对于人类免疫缺陷病毒的检测可以覆盖所有已知亚型，同时，本专利技术通过优化引物设计，使得扩增产物的片段长度在100-150bp之间，且退火温度在56-62℃之间，并通过赛默飞引物分析在线工具对所设计引物之间的相互作用进行分析，确保引物之间的相互作用不会对体系产生影响；5)本专利技术通过优化引物探针，使得针对每种病毒的引物探针仅可检测该种病毒，不会与人基因组或者人乙型肝炎病毒(HBV)核酸、人疱疹病毒(EBV)核酸、巨细胞病毒(CMV)核酸等常见的病毒核酸发生交叉反应，保证了阳性结果的精确性。附图说明图1是本专利技术一典型实施方案中采用的样品处理装置的结构示意图。图2是本专利技术实施例1中阴性对照的液滴荧光检测结果。图3是本专利技术实施例1中1号阳性样品的滴荧光检测结果。图4是本专利技术实施例1中2号阳性样品滴的荧光检测结果。图5是本专利技术实施例2中参考品A的液滴荧光强度检测结果。图6是本专利技术实施例2中参考品B的液滴荧光强度检测结果。图7是本专利技术实施例2中参考品C的液滴荧光强度检测结果。图8是本专利技术实施例2中参考品D的液滴荧光强度检测结果。图9是本专利技术实施例3中HBV、CMV、EBV与HIV阳性样品的液滴荧光强度检测结果。具体实施方式下文将对本专利技术的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本专利技术范围内，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。本专利技术将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不起到限制性作用。在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。本专利技术实施例的一个方面提供了一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的引物组，其包括：第一引物对，其包括第一引物(即正向引物)和第二引物(即反向引物)，其序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示；第二引物对，其包括第三引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的引物组，其特征在于包括：第一引物对，其包括第一引物和第二引物，其序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示；第二引物对，其包括第三引物和第四引物，其序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的引物组，其特征在于包括：第一引物对，其包括第一引物和第二引物，其序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示；第二引物对，其包括第三引物和第四引物，其序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。2.一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的探针对，其特征在于包括：第一探针，其序列如SEQIDNO.5所示；第二探针，其序列如SEQIDNO.6所示。3.一种检测人类免疫缺陷病毒核酸的试剂盒，其特征在于包括至少一套引物组和至少一组探针对，其中一套引物组包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对包括第一引物和第二引物，其序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示，所述第二引物对包括第三引物和第四引物，其序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示，其中一组探针对为权利要求2所述的探针对。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于还包括病毒内标引物对、内标探针，其中所述病毒内标引物对包括第一内标引物和第二内标引物，所述第一内标引物的序列如SEQIDNO.7所示，所述第二内标引物的序列如SEQIDNO.8所示，其中内标探针的序列如SEQIDNO.9所示。5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于还包括PCR扩增检测的常规组件；优选的，所述PCR扩增检测的常规组件包括PCR反应用缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、DNA聚合酶、RNA逆转录酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、水以及液滴生成液；尤其优选的，所述PCR反应用缓冲液包含氯化钾、Tris-HCl和镁离子。6.权利要求3-5中任一项所述的试剂盒于制备检测人类免疫缺陷病毒核酸的产品中的用途。7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，应用所述产品检测人...

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠丹，戴敬，赵洪玉，节淳皓，
申请(专利权)人：苏州德思普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32