一种Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的方法技术

本发明专利技术属于果树病毒检测技术领域，具体涉及一种Small‑RNA高通量测序技术快速准确诊断甜樱桃病毒的方法。采用以下步骤：从NCBI搜索所有植物病毒序列信息，以E‑value≤1e‑50为标准，得到初选序列库，去除同源性≥97%的序列即为甜樱桃病毒数据库；提取甜樱桃叶片中的总RNA，构建小RNA测序文库，并进行Small‑RNA深度测序；获得small RNA测序序列；处理后的序列进行组装；组装出来的序列进行拼接，得到病毒的相关序列。本发明专利技术测序技术对甜樱桃树体内的病毒病样本进行快速、准确的诊断，弥补了常规病毒检测方法的不足，实际指导了甜樱桃病毒病的防控。

A Small-RNA High-throughput Sequencing Method for Detecting Sweet Cherry Virus

The invention belongs to the field of fruit tree virus detection technology, in particular to a method for rapid and accurate diagnosis of sweet cherry virus by small RNA high-throughput sequencing technology. The following steps were adopted: searching all plant virus sequence information from NCBI, using E_value (<1e 50) as the standard, obtaining the primary sequence library, removing the sequence with homology (>97%) was the Sweet Cherry Virus database; extracting the total RNA from the leaves of sweet cherry, constructing the small RNA sequencing library, and carrying out small RNA deep sequencing; obtaining the small RNA sequencing sequence; assembling the processed sequence. The assembled sequence is spliced to get the relevant sequence of the virus. The sequencing technology of the invention can rapidly and accurately diagnose virus disease samples in sweet cherry trees, make up for the deficiency of conventional virus detection methods, and guide the prevention and control of virus diseases in sweet cherry trees.

【技术实现步骤摘要】
一种Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的方法
本专利技术属于果树病毒检测
，具体涉及一种Small-RNA高通量测序技术快速准确诊断甜樱桃病毒的方法。
技术介绍
高通量测序技术现已广泛应用于真核生物、原核生物、病毒等的基因组、转录组、基因表达调控研究，具体的分析技术包括：1.Denovo重头测序，2.DNA重测序，3.RNA转录组、表达谱测序，4.MicroRNA发现及分析，5.甲基化测序，6.DNA-蛋白质互作研究，7.目的区域捕获测序，8.外显子测序。甜樱桃因其果实早熟、酸甜可口，而深受大众喜爱，种植效益高，成为近年来发展较快的果树树种之一。但是甜樱桃为无性繁殖，新品种的推广和苗木繁育主要通过嫁接进行，长期的无性繁殖使得甜樱桃品种和砧木树体内的病毒数量不断增加，病毒病的危害越来越严重，对我国的甜樱桃产业的发展造成了重大危害。据报道全世界能够危害甜樱桃的病毒种类高达40余种，我国发现10余种。因此，亟需一种快速、准确判定甜樱桃树体内病毒情况的方法。目前常用的甜樱桃树体病毒检测方法有物理学方法(电镜法)、血清学方法(酶联免疫ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)法，但这些方法的使用范围是有限的，如物理学方法需要利用电子显微镜技术来判断是否有病毒以及病毒种类，这种方法需要专门的操作人员熟练使用电子显微镜，而且材料处理繁琐、耗时、难度大；血清学需要病毒在甜樱桃树体内得以表达并翻译成蛋白质，这种方法需要提前预知树体内的病毒种类，获得病毒的蛋白质序列，而且血清学检测结果灵敏度低、准确性差；近年来大家常用的PCR法必须基于已知病毒的核苷酸序列才能进行，检测病毒的范围比较固定，难于发现新病毒，而且病毒在植物体内转录表达才能被检测到，受植物细胞活性影响很大，如秋季的叶片和冬季的芽中几乎检测不到病毒的表达。总的来说，在对未知病原物缺乏了解的情况下，这些检测方法就无法应用。因此，检测已知或未知的甜樱桃病毒需要一个更为有效的方法来筛选疑似感染病毒的样品。
技术实现思路
本专利技术采用Small-RNA测序技术对甜樱桃树体内的病毒病样本进行快速、准确的诊断，弥补了常规病毒检测方法的不足，实际指导了甜樱桃病毒病的防控。为实现上述目的，本专利技术采用以下方案：一种Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的方法，采用以下步骤：(1)从NCBI搜索所有植物病毒序列信息，以E-value≤1e-50为标准，得到初选序列库，去除初选序列库中同源性≥97％的序列即为甜樱桃病毒数据库；(2)提取甜樱桃叶片中的总RNA，构建小RNA测序文库，并进行Small-RNA深度测序；(3)获得smallRNA测序序列；(4)步骤(3)处理后的序列进行组装，对于组装出的大于100bp的重叠群寻找高度同源序列：首先，用blastn将组装的重叠群比对到病毒核酸数据库中，选出每一条序列的比对结果中e值最小的结果，再筛选出比对序列的同源性达到90％的结果；设定如下比对参数：比对长度大于16nt，2个错配碱基以内，e＝0.01；(5)将步骤(4)组装出来的序列进行拼接，得到病毒的相关序列。优选地，步骤(2)所述的提取甜樱桃叶片中的总RNA的方法为：利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，提取甜樱桃叶片中总RNA。优选地，步骤(2)所述的Small-RNA深度测序通过HiSeq2000高通量进行。优选地，步骤(3)所述的获得smallRNA测序序列的方法为检测smallRNA测序质量，并去除低质量、未插入3'接头、5'接头序列，再除去带PolyA尾巴和3'接头的数据，最后选取不小于18nt的序列。有益效果(1)本专利技术在未知病毒信息的情况下，利用Small-RNA测序技术快速、准确检测甜樱桃树体内病毒，在甜樱桃检验检疫中有着重要的应用意义。(2)本专利技术从NCBI搜索所有植物病毒序列信息，构建了全面的甜樱桃病毒基因序列数据库。所述方法简便、快速，灵敏度高、准确性好，而且不需要知道樱桃树体内病毒信息，也不受植物细胞活性影响。附图说明图1为Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的流程图；图2为测序结果中病毒来源sRNAs与病毒基因组的mapping及热点区域分析；图3为LChV-1RT-PCR产物测序结果和高通量测序拼接结果对比；图4为CVART-PCR产物测序结果和高通量测序拼接结果对比；图5为CLBVRT-PCR产物测序结果和高通量测序拼接结果对比；图6为PBNSPaVRT-PCR产物测序结果和高通量测序拼接结果对比。具体实施方式下面对本专利技术原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本专利技术，并非限定本专利技术的范围。实施例11.1构建甜樱桃病毒序列数据库从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/)搜索所有植物病毒序列信息，以E-value≤1e-50为标准，得到初选序列库。然后这些序列再进行同源性分析，对同源性≥97％的序列视为重复序列，去除重复序列后即为甜樱桃病毒数据库。1.2高通量数据分析一份已知病毒的样品S1的甜樱桃叶片，带有樱桃病毒A(CherryvirusA,CVA)和樱桃小果病毒1(Littlecherryvirus1,LChV-1)；随机在大田中取一份带有未知病毒的样品S2的甜樱桃叶片，将样品S1和样品S2放在冻存管中，快速放入液氮中直接保存。按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根)步骤提取样品中的总RNA，构建小RNA测序文库，通过HiSeq2000高通量测序平台进行Small-RNA深度测序，得到的原始读数均超过1400万reads。去除低质量、未插入3'接头、5'接头reads，再除去带PolyA尾巴和3'接头的数据，最后选取不小于18nt的reads。处理后的高质量读数在1300万reads以上，高质量读数占比超过85％，序列总长度分别为460,791,072nt和345,940,499nt左右，具有很好的深度和一致性，可进行后续的分析(表1)。表12份甜樱桃样品SmallRNA的深度测序分析1.3样品中病毒序列分析1.2处理后的序列用软件SOAPdenovo进行组装，组装的大于100bp的contig寻找高度同源序列：首先，用blastn将组装的contig比对到病毒核酸数据库中，选出每一条序列的比对结果中e值最小的结果，再筛选出比对序列同源性达到90％的结果。为了分析到尽可能多的病毒sRNAs，设定如下参数：匹配长度大于16nt，2个错配碱基以内，e＝0.01，进一步与数据库blast比对计算样品中病毒存在情况。比对结果发现S1样品中检测到病毒LChV-1的contig9条，最长序列395bp，这些序列与病毒数据库中LChV-1病毒序列同源性都超过90％。S1样品中还检测到病毒CVA的contig12条，最长序列357bp，这些序列与病毒数据库中CVA病毒序列同源性都超过90％。由此推断样品S1中存在LChV-1病毒和CVA病毒，于已知数据相同。S2样品中检测到柑橘叶疱斑病毒(Citrusleafblotchvirus,CLBV)的contig7条，最长序列436bp，这些序列与病毒数据库中CLBV病毒序列同源性都超过90％。S2样品中还检测到李树皮坏死茎纹孔伴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Small‑RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的方法，其特征在于，采用以下步骤：（1）从NCBI搜索所有植物病毒序列信息，以E‑value≤1e‑50为标准，得到初选序列库，去除初选序列库中同源性≥97%的序列即为甜樱桃病毒数据库；（2）提取甜樱桃叶片中的总RNA，构建小RNA测序文库，并进行Small‑RNA深度测序；（3）获得small RNA测序序列；（4）步骤（3）处理后的序列进行组装，对于组装出的大于100bp的重叠群寻找高度同源序列：首先，用blastn 将组装的重叠群比对到病毒核酸数据库中，选出每一条序列的比对结果中e值最小的结果，再筛选出比对序列的同源性达到90%的结果；设定如下比对参数：比对长度大于16nt，2个错配碱基以内，e=0.01；（5）将步骤（4）组装出来的序列进行拼接，得到病毒的相关序列。

【技术特征摘要】
1.一种Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的方法，其特征在于，采用以下步骤：（1）从NCBI搜索所有植物病毒序列信息，以E-value≤1e-50为标准，得到初选序列库，去除初选序列库中同源性≥97%的序列即为甜樱桃病毒数据库；（2）提取甜樱桃叶片中的总RNA，构建小RNA测序文库，并进行Small-RNA深度测序；（3）获得smallRNA测序序列；（4）步骤（3）处理后的序列进行组装，对于组装出的大于100bp的重叠群寻找高度同源序列：首先，用blastn将组装的重叠群比对到病毒核酸数据库中，选出每一条序列的比对结果中e值最小的结果，再筛选出比对序列的同源性达到90%的结果；设定如下比对参数：比对长度大于16nt，2个错配...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱东姿，王甲威，刘庆忠，陈新，魏海蓉，宗晓娟，徐丽，谭钺，张力思，洪坡，
申请(专利权)人：山东省果树研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37