本发明专利技术涉及一种微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法，包括以下步骤：分别对肿瘤患者的癌变组织样本和正常组织对照品进行DNA片段化处理，末端补齐加A尾，进行接头连接；设计用于目的区域捕获的引物和探针以及用于扩增的引物，探针是分别针对五个微卫星位点的单向DNA延伸探针，采用探针和引物进行目的区域捕获后扩增得到文库；测序得到癌变组织样本和正常组织对照品的五个微卫星位点的重复序列长度分布数据，对比两者数据，判断微卫星位点的稳定性。本发明专利技术还涉及一种微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组。本发明专利技术的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法可以减少测序深度对结果判定的影响，简单易行，准确度高，灵敏度高，成本低。
【技术实现步骤摘要】
微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组及其检测方法
本专利技术涉及一种微卫星不稳定性水平评估的二代测序方法及其所用的引物和探针，属于生物
技术介绍
微卫星是指基因组上短的重复的DNA序列，这些重复序列包括单核苷酸重复、二核苷酸重复和多核苷酸重复序列。这些重复区域在DNA复制的过程中易引起碱基对的错配，从而导致重复区域长度的变化。不过，正常人体内存在健全的错配修复(MMR)系统可修复错配引起的后果。微卫星不稳定性(MSI)指的是DNA重复区域长度的变化，这种变化是由于MMR蛋白功能的缺失导致的，并且这种现象在结直肠癌患者中的发生概率高达20％。MSI可进一步分为高不稳定性(MSI-H)与低不稳定性(MSI-L)，检测的微卫星位点中有大于等于30％的位点表现出不稳定性定义为高不稳定性，有小于30％的位点表现出不稳定性定义为低不稳定性。表现出MSI-H的结直肠癌患者提示为存在MMR缺陷，MSI-H肿瘤患者对化疗药5-氟脲嘧啶不敏感，需选择其他化疗方案。此外，近期研究表明，MSI-H患者在接受PD-1/PD-L1抗体时比MSI-L与MSS患者具有更好的临床反应。因此，MSI水平检测也可用于免疫检查点抑制剂类药物的辅助疗效的预测。对结直肠癌患者MSI水平进行高效准确的检测成为一种需求。传统的MSI水平检测方法主要有：免疫组化方法，微卫星位点PCR法与Sanger测序法。传统的检测方法，不同程度的表现出一定的局限性。免疫组化方法操作复杂，特异性低；微卫星位点PCR法对通量低；直接测序法周期长、成本高且准确度低。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可以减少测序深度对结果判定的影响，简单易行，准确度高，灵敏度高，成本低的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法，以及使用该方法的引物探针组。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组，包括探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4、探针MSI-5、引物FP-1和引物UP-2；所述探针MSI-1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述探针MSI-2的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针MSI-3的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述探针MSI-4的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述探针MSI-5的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述引物FP-1的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述引物UP-2的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。上述探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4、探针MSI-5和引物FP-1用于目的区域捕获；所述引物FP-1和引物UP-2用于扩增。上述各探针在反应体系中的最终浓度均为200nM，各引物在反应体系中的最终浓度为400nM。本专利技术为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法，不用于疾病的诊断和治疗，包括以下步骤：A.分别对肿瘤患者的癌变组织样本和正常组织对照品进行DNA片段化处理，末端补齐加A尾，进行接头连接；B.设计用于目的区域捕获的引物和探针以及用于扩增的引物，所述探针是分别针对五个微卫星位点的单向DNA延伸探针，采用所述探针和引物进行目的区域捕获后扩增得到文库；C.测序得到癌变组织样本和正常组织对照品的五个微卫星位点的重复序列长度分布数据，对比两者数据判断微卫星位点的稳定性。上述步骤C中，将微卫星位点的重复序列长度分布数据绘制成MSI分析结果图，对比两者的MSI分析结果图，判断微卫星位点的稳定性；图中的横坐标为重复序列的长度，图中的纵坐标为重复序列各长度的reads总数与覆盖该位点reads总数的比值，通过比较图中的重复序列长度分布图形从而对比两者数据。对比两者的MSI分析结果图，若两图中主峰的横坐标差值大于等于1bp，或者量两图中主峰的横坐标±3bp内，存在2个或2个以上纵坐标差值大于等于0.1的峰，或者两图中主峰的横坐标±3bp外，存在纵坐标差值大于等于0.3的峰，则判断该微卫星位点为不稳定；反之，则判断该微卫星位点为稳定。上述单向DNA延伸探针包括5’端的illumina文库的通用接头序列和3’端的特异性互补序列，所述二代测序特异性互补序列能与相应微卫星位点上游或下游50bp长度内的基因组序列特异性互补的。上述特异性互补序列的长度为25bp至45bp。上述针对五个微卫星位点的单向DNA延伸探针分别是探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4和探针MSI-5，所述探针MSI-1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述探针MSI-2的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针MSI-3的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述探针MSI-4的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述探针MSI-5的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。上述用于目的区域捕获的引物是引物FP-1，用于扩增的引物是引物FP-1和引物UP-2，所述引物FP-1的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述引物UP-2的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。本专利技术具有积极的效果：(1)本专利技术的检测方法从人类hg19参考基因组选取的五个微卫星位点用于MSI水平的检测，五个微卫星位点均为单核苷酸重复的位点，采用患者的癌变组织和正常组织可对患者的MSI水平进行评估，属于首创，经验证对结直肠癌患者化疗方案具有指导作用。(3)本专利技术的检测方法采用单向DNA延伸探针进行目的区域捕获，相较于传统的多重PCR捕获方法，增大了片段化样本DNA的利用率，相较于传统的RNA探针杂交捕获方法，降低了建库成本。探针的3’端的特异性互补序列延伸起点距离目的微卫星位点的长度小于50bp，距离微卫星位点较近，提高了捕获效率，保证了探针捕获的高效性。探针的5’端采用illumina文库的通用接头序列，这样设计极大的简化了检测步骤。(4)本专利技术的检测方法建库步骤为样本DNA片段化、连接接头、靶向区域捕获与通用扩增，均为常用NGS建库步骤，试剂要求较低。(5)本专利技术的检测方法将测序所得数据，绘制成分析结果图，横坐标为重复序列的长度，纵坐标为重复序列各长度的reads总数与覆盖该位点reads总数的比值，这大大减少了测序深度对结果判定的影响。附图说明图1是直肠癌肿瘤组织MSI-1位点的MSI分析结果图；图2是直肠癌癌旁组织切片MSI-1位点的MSI分析结果图；图3是直肠癌肿瘤组织MSI-2位点的MSI分析结果图；图4是直肠癌癌旁组织切片MSI-2位点的MSI分析结果图；图5是直肠癌肿瘤组织MSI-3位点的MSI分析结果图；图6是直肠癌癌旁组织切片MSI-3位点的MSI分析结果图；图7是直肠癌肿瘤组织MSI-4位点的MSI分析结果图；图8是直肠癌癌旁组织切片MSI-4位点的MSI分析结果图；图9是直肠癌肿瘤组织MSI-5位点的MSI分析结果图；图10是直肠癌癌旁组织切片MSI-5位点的MSI分析结果图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
技术实现思路
对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。下述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组，其特征在于：包括探针MSI‑1、探针MSI‑2、探针MSI‑3、探针MSI‑4、探针MSI‑5、引物FP‑1和引物UP‑2；所述探针MSI‑1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述探针MSI‑2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探针MSI‑3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针MSI‑4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探针MSI‑5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述引物FP‑1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述引物UP‑2的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
【技术特征摘要】
1.一种微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组，其特征在于：包括探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4、探针MSI-5、引物FP-1和引物UP-2；所述探针MSI-1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述探针MSI-2的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针MSI-3的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述探针MSI-4的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述探针MSI-5的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述引物FP-1的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述引物UP-2的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。2.根据权利要求1所述的微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组，其特征在于：所述探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4、探针MSI-5和引物FP-1用于目的区域捕获；所述引物FP-1和引物UP-2用于扩增。3.根据权利要求1所述的微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组，其特征在于：各探针在反应体系中的最终浓度均为200nM，各引物在反应体系中的最终浓度为400nM。4.一种微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，包括以下步骤：A.分别对肿瘤患者的癌变组织样本和正常组织对照品进行DNA片段化处理，末端补齐加A尾，进行接头连接；B.设计用于目的区域捕获的引物和探针以及用于扩增的引物，所述探针是分别针对五个微卫星位点的单向DNA延伸探针，采用所述探针和引物进行目的区域捕获后扩增得到文库；C.测序得到癌变组织样本和正常组织对照品的五个微卫星位点的重复序列长度分布数据，对比两者数据，判断微卫星位点的稳定性。5.根据权利要求4所述的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法，其特征在于：所述步骤C中，将微卫星位点的重复序列长度分布数据绘制成MSI分析结果图，对比两者的MSI分析结果图，判断微卫星位点的稳定性；图中的...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵新泰，王明，潘文健，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。