乙肝病毒肝内整合状况的感染者外周血检测方法技术

本发明专利技术提供了乙肝病毒整合状况的检测方法，该方法以外周血中的游离DNA作为样品进行检测。所述方法能够避免手术活检、穿刺活检等传统方法的并发症风险，提高安全性，可以实现更高频繁的定期监测，而且避免了组织取样的异质性偏差。本发明专利技术的方法特异性好、灵敏度高，可以在100％的HBV感染后肝癌患者的外周血样本中检测到，最低可以在5ml外周血血浆提取到的全部cfDNA中检测到片段。

【技术实现步骤摘要】
乙肝病毒肝内整合状况的感染者外周血检测方法
本专利技术涉及乙肝病毒整合状况的检测，特别涉及外周血游离DNA在乙肝病毒整合状况检测中的应用。
技术介绍
乙肝病毒(HepatitisBVirus,HBV)作为逆转录病毒，具有整合入宿主基因组的能力，最早在20世纪八十年代早期就被报道，在肝癌基因组中的研究也有很多积累1-13。HBV的整合能力并不是其生活史(LifeCycle)以及感染宿主所必须，肝病毒基因组中目前不认为存在基因编码有整合酶活性的病毒蛋白14，早期的研究曾认为HBV整合事件是在全基因组随机分布的罕见事件15。HBV整合机制的研究认为，病毒整合入宿主基因时的主要形式是线性双链DNA(doublestrandlinearDNA，dsLDNA)16，是cccDNA形成过程中的中间体，而cccDNA是HBV感染慢性化中最关键的一环17，因而推断整合事件可以伴随着HBV慢性感染的全过程。虽然研究人员不断尝试构建可以用于HBV生活史研究的细胞、动物模型，但一直以来尚未有成熟体系18，对cccDNA相关的生物学过程研究基于鸭乙型肝炎病毒(DHBV)，包括目前估计的103～104个感染的细胞中会发生一次整合也是基于DHBV感染实验16。最早研究者曾认为整合入宿主基因组中的病毒片段处于失活(Defective)状态无法产生蛋白，后续研究提示整合频率最高的HBV基因组片段为DR2-DR1区域以及preS/S基因区域19，会分别翻译产生截短型的X蛋白、表面蛋白20，并通过各自特定机制诱发肝细胞向肿瘤细胞转变21,22，因而此类现象也被认为属于整合事件在肝脏病程进展中的反式(Trans)作用。最新研究报道，整合的片段与邻近的基因可产生嵌合转录本(ChimericTranscripts)，如HBV-MLL423、HBV-cyclinA224；ChiuYT等人提出存在pre-mRNAsplicing机制，使其可以翻译出无法被宿主细胞降解的病毒-人嵌合蛋白，导致细胞周期进程加快24。近年来更是认为慢性感染中整合的病毒DNA片段也会继续在受累的人肝脏细胞中翻译产生病毒的蛋白质影响一系列细胞的功能活动以及宿主的免疫反应25,26。HBV整合除了在不同感染者间存在一定异质性(Heterogeneity)外，在同一患者体内也可以观测到多次的整合事件。2012年，SungWK等人在对81例HBV感染后肝癌的WGS结果中发现近400个整合事件，单个肿瘤最多存在16个不同的HBV整合，其中年轻肝癌患者肿瘤组织中可以观测到更多的病毒整合19。此外，2015年YanH等人的研究也发现在病毒感染后早发肝癌(<30岁)患者中的整合模式与晚发肝癌(>70岁)患者中存在差别，在前者肝脏肿瘤组织中发现了更多可能影响肝细胞的病毒整合事件27。因而，上述发现亦支持HBV整合可能赋予肝细胞生长优势的观点，整合可以加速肝脏病变发展的进程。同时，肿瘤的优势克隆中可均含有同一特定HBV整合，基于此MiaoR等人通过肿瘤全基因组测序数据分析HBV整合在2例肝内多发肿瘤中的差异，成功鉴别出肿瘤的克隆起源：具备相同HBV整合的多肿瘤病灶属于单克隆起源，HBV整合事件不同则为多克隆起源，两者可具有不同的临床预后28。2008年流调查数据显示，中国约有慢性HBV携带者9300万人，其中慢性乙型肝炎患者1900万人，虽然乙肝疫苗的广泛应用使得感染得到了非常有效的控制，但慢性感染人群仍具有相当大的基数，其肝脏病变发展的评估和肝癌的预警一直是病毒性肝炎治疗中的重点。上世纪八十年代肝癌中的整合病毒片段分析多基于限制性酶切或者Southern杂交技术，获得的目标片段通过一代测序进行后续验证确定1-9。实验流程繁琐、分析通量低，因而无法从全局上分析整合事件的生物学影响。1995年,Minami等人开发了ALUPCR策略在基因组中筛查整合位点使得病毒整合分析的通量得以提升29,30。然而该策略的前提是病毒整合需要发生在ALU片段附近，这种前提假设破坏了分析的无偏性，不处于ALU片段区域的整合是无法被该技术捕捉到的。此外，PCR技术对片段的扩增中，会因为其固有的TemplateSwitching的问题造成假阳性的结果，即把肝癌组基因组和游离病毒DNA在扩增时连接在一起31,32。近几年随着高通量测序技术的广泛应用，研究人员在大量肝癌样本中开展全基因组序列测定(WholeGenomeSequencing，WGS)或基于Alu-PCR对整合位点的筛查19，其中2014年LiX等人通过荟萃已报道的1115次整合事件，对HBV在肝癌基因组中的发生频率、整合规律有了更深入的刻画33。目前认为，整合事件多发生在染色体的转录活跃的区域，可能通过顺式(Cis)调控作用影响临近基因的表达17。虽然这种表达活性的变化在肿瘤发生发展中的作用仍需深入探讨，但存在高频整合靶向基因被多个研究共同报道，并且多涉及细胞的存活、增殖和永生化等生物学过程，例如端粒酶逆转录酶基因(TERT)、组蛋白甲基转移酶(MLL4)以及细胞周期蛋白E1(CCNE1)等19,28,34。此外，整合发生的区域也存在典型的序列特征，更容易出现在基因组不稳定的区域如重复序列、长散在重复序列、短散在重复序列、微卫星、端粒、中心粒区域35,36，甚至整合位点本身存在基因组的结构变异37，一些染色体(5,、16、17、19号)被确定更容易发生HBV病毒整合38-43。然而全基因测序技术的成本依旧十分昂贵，尤为重要的是，80-90％HBV感染后肝癌组织中可发现病毒的整合事件，因而其在肝癌发生发展中的作用不容忽视44。液体活检(Liquidbiopsy)技术近年来迅速发展，在外周血中检测游离DNA(cellfreeDNA，cfDNA)成为监测患者疾病病程进展的重要手段45。HBV感染造成的肝脏损伤程度不同时，患者外周血中cfDNA水平存在差别，例如在HBV感染后急性肝衰竭患者中，cfDNA水平的升高可帮助判断患者的预后46；除了cfDNA数量的变化，一些慢性携带者的cfDNA上可以检测到TP53基因的突变，提示此类患者肝脏肿瘤发生风险可能会提高47；已有尝试通过监测HBV感染不同阶段血浆cfDNA的甲基化改变，发现cfDNA中NF300、SLC22A20和SHISA等基因的甲基化水平在慢肝、肝硬化和肝癌患者中存在差异，将其作为筛选肿瘤高风险人群的标志物48。然而，利用cfDNA检测突变和甲基化等情况所能提供的信息仍然十分有限，有必要探索提供更多信息量的手段。病毒整合作为HBV感染后肝细胞基因组中的特征性事件，目前国内外尚未有研究探索整合位点的DNA片段是否能被释放至外周血，更无研究探索其是否有足够的特异性和灵敏性以用于检测分析。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人首次发现HBV整合位点的DNA片段能够被释放至外周血，并且能够用于检测分析。本专利技术的一个目的在于提供一种检测受试者的乙肝病毒整合状况的方法，可通过液体活检等非侵入方式实现，以避免手术活检和穿刺活检等组织活检方式所存在的安全性风险以及采样困难、样品异质性等缺陷。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种检测受试者的乙肝病毒整合状况的方法，该方法以外周血中的游离DNA作为样本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测或监测受试者的乙肝病毒整合状况的方法，其特征在于，以外周血中的游离DNA作为样品进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种检测或监测受试者的乙肝病毒整合状况的方法，其特征在于，以外周血中的游离DNA作为样品进行检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙肝病毒整合状况是受试者肝组织或肝细胞的乙肝病毒整合状况，通过检测外周血游离DNA中的乙肝病毒整合事件，以反映出受试者肝组织或肝细胞的乙肝病毒整合状况；优选地，所述乙肝病毒整合状况是肝组织或肝细胞中的乙肝病毒整合事件谱。3.一种检测受试者cfDNA中乙肝病毒整合事件的方法。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述包括如下步骤：(a)提取外周血游离DNA；(b)对步骤(a)提取的外周血游离DNA进行末端修复，与接头连接，纯化连接产物；(c)任选地，对步骤(b)获得的DNA进行预扩增，纯化扩增产物；(d)使用能够与乙肝病毒基因组序列杂交的探针在步骤(b)或步骤(c)获得的DNA产物中进行捕获；(e)对步骤(d)获得的捕获产物进行测序；(f)通过生物信息学分析确定乙肝病毒整合事件。5.一种用于确定受试者的乙肝病毒整合状况的生物信息处理方法，其特征在于，通过外周血游离DNA中的乙肝病毒整合事件，反映受试者的乙肝病毒整合状况。6.一种检测受试者肝细胞过量增殖的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大可，
申请(专利权)人：张大可，
类型：发明
国别省市：北京,11